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动物细胞染色体DNA之制备详细的方法步骤！
阅读：2260 发布时间：2012-10-18
动物细胞染色体DNA之制备
I.目的
动物、植物及微生物等的基因图谱（gene mapping）的构筑，以及基因顺序（gene sequencing）的建立与分析比较，是目前分子生物研发的重要课题。本实验设计乃针对动物细胞培养之后，抽取染色体DNA为*步，后续的DNA定序、基因分析、图谱建立、DNA鑑定等于渊展开。
以目前的估计，人类约有10万个基因，30亿个碱基。预定在2005年将人类基因*解析出来，并确定它们在染色体上的位置。根据1990年当时的物价，每解析出一个碱基的平均成本约为美金1元，故HGP总共需约30亿美金来完成。
一旦人类基因舆图*解析出来之后，科学家就可以寻找每段基因的功能，利用这些资料进一步找出疾?。ㄈ鏰i症或心脏?。┯牖虻墓叵担硗庖嗵峁┛⑿乱┗蜓罢倚轮瘟品椒ǖ牧煊?，如同在美国NASDAQ上的网路股一样，充满了无限的想像空间。在巨大商业利益的引诱之下，许多私人制药公司已经开始投入HGP的研究工作，期能将重要的基因找出来
II.染色体DNA的制备
1.仪器用具：
a. 无菌操作台
b. 37 ℃细胞培养箱
c. 倒立显微镜
d. 50 ℃恒温箱具摇盪器
e. 冷冻离心机
2.药品及试剂：
a. 同实验20
b. Digestion buffer （100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 25 mM EDTA, 0.5% SDS, fresh 0.1 mg/ml proteinase K）
c. phenol/chloroform
3.方法步骤：
１）培养HeLa细胞在100 mm培养皿中3~4天，让细胞佔满生长平面空间（confluence < 3 ´ 107 cells ），加入10 ml PBS缓衝液清洗细胞表面，再将PBS儘量*吸掉。
２）加入1 ml Trypsin-EDTA（以能覆盖细胞表面为原则），置入37 °C细胞培养箱数分钟，单层细胞全脱落。
３）加入3 ml培养液冲洗下细胞，在4 °C下以4,000 rpm离心1分钟。
４）吸掉上层液，加入5 ml PBS悬浮细胞，在4 °C下以4,000 rpm离心1分钟。
５）吸掉上层液，加入30 ml digestion buffer悬浮细胞转移到1.5 ml微量离心管中，置于摇盪器上放入50 °C恒温箱中过夜*。
６）取出微量离心管，小心加入300 ml phenol 萃取（参照实验2）。
７）离心后转移上清液至新的微量离心管，加水成总体积为500 ml，加入phenol/chloroform做萃取（参照实验2）。
８）离心后，做酒精沈淀DNA（参照实验2）。
９）将染色体DNA悬浮于300 ml TE溶液中，取少量作DNA定量分析（参照实验2）。
10）取染色体DNA用EcoRI做限制酶切割，并做DNA电泳分析（参照实验3）。
*注：1.在步骤5之后，若DNA黏滞性太高，无法做萃取时，建议在过夜反应后，以1ml针筒剧烈抽放染色体DNA，以抽放重覆动作，可把DNA作物理性截断（shearing），或利用超音波破膜机来截断DNA。
2.染色体DNA若有截断处理，到步骤10即可省略限制酶EcoRI的切割，直接作电泳分析。
参考资料:
显微镜百科
http://www.jiance17.com