細胞培養(yǎng)基的種類繁多，細胞培養(yǎng)方式也較多，如何正確地使用培養(yǎng)基及地保持培養(yǎng)基的營養(yǎng)以維持細胞的生長，對每個培養(yǎng)者都很重要。培養(yǎng)基的使用依不同的培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)方式、細胞種類的不同而存在差異。

一、細胞培養(yǎng)液的構成

細胞培養(yǎng)液指細胞生長的液體環(huán)境，一般指培養(yǎng)液，添加了血清、水解乳蛋白、各種添加劑等可以直接使用的培養(yǎng)液。

1、細胞培養(yǎng)基&血清模式

血清對于在傳統(tǒng)培養(yǎng)基配方中生長和增殖的大多數細胞系來說是需要的，因為大多數單獨的培養(yǎng)基并不能提供細胞生長所需要的全部營養(yǎng)，如MEM培養(yǎng)基，較為常用的量為5％～10％的比例，而特殊的低血清培養(yǎng)基血清量可降至3％左右，細胞的形態(tài)和功能不受影響。

2、細胞培養(yǎng)基&乳歐液模式

化學合成培養(yǎng)基現雖已大規(guī)模使用，但在某些培養(yǎng)領域水解乳蛋白仍在使用，以補充培養(yǎng)液中缺乏的氨基酸、小肽物質。較為常用的方式是用漢氏（Hanks’ BSS）或歐式(Earle’s BSS)平衡液溶解水解乳蛋白（一般為5‰濃度），即成乳漢（歐）液，再與化學合成培養(yǎng)基（一般為MEM）按比例混合使用（如1：1）。

3、細胞培養(yǎng)基&各類添加劑（生長因子等）模式

成分復雜的培養(yǎng)基還含有許多化合物，包括蛋白質、多肽、核苷、檸檬酸循環(huán)的中間產物、丙酮酸及脂類等。已發(fā)現當培養(yǎng)基中的血清濃度減少時，這些成分都是必需的。既使在使用血清的情況下，這些成分也可幫助細胞的克隆化培養(yǎng)及維持某些特殊細胞系的生長。激素和生長因子在大多數常規(guī)培養(yǎng)基的配方中都沒有注明，但在無血清培養(yǎng)基中通常要加入它們，用其來代替血清中的激素能增加多種不同類型細胞的貼瓶率；生長因子包括FGF家族、EGF、PDGF、IGF－1和IGF－2及白介素等，生長因子和細胞因子有著廣泛的特異性，一般與激素或其它物質起相互協(xié)同或加成作用。另一種常見的添加物就是血清替代物，目前已有許多可或部分替代傳統(tǒng)培養(yǎng)液中血清成分的商業(yè)產品，其穩(wěn)定性較好，但批次間仍有差別，產品的成分也不很確定。

二、細胞培養(yǎng)基配制

1、干粉培養(yǎng)基原倍液的配制

1）配制過濾除菌的細胞培養(yǎng)基

(1)閱讀培養(yǎng)基使用說明，確定需要添加何種添加劑（如NaHCO3、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等）。

(2)根據所需將培養(yǎng)基全部倒入一容器中，用少量注射用水（20℃～30℃）將袋內殘留培養(yǎng)基洗下，并入容器。加注射用水至總體積的95％，輕微攪拌溶解。

(3)加入規(guī)定量的碳酸氫鈉及所要添加的物質。

(4)輕微攪拌溶解，加注射用水至規(guī)定體積。

(5)用1 mol / L 氫氧化鈉溶液或 1 mol / L 鹽酸溶液調pH至所需值。

(6)用0.22 μm濾膜正壓過濾除菌。

(7)溶液應在2℃－8℃下避光保存。

具體使用方法參照培養(yǎng)基包裝袋上的說明書。

2）配制可高壓滅菌細胞培養(yǎng)基

(1)根據所需將培養(yǎng)基全部倒入一容器中，用少量注射用水（20℃～30℃）將袋內殘留培養(yǎng)基洗下，并入容器。加注射用水至總體積的95％，輕微攪拌溶解。

(2)在121℃、15psi下滅菌15分鐘。

(3)待溶液冷卻至室溫，加入無菌0.2 mol / L L－谷氨酰胺溶液規(guī)定體積、無菌7.5％（w/v）碳酸氫鈉溶液規(guī)定體積，加注射用水（20℃～30℃）至規(guī)定體積，混勻。

(4)如果必要，用1 mol / L 氫氧化鈉溶液或 1 mol / L 鹽酸溶液調pH至所需值。

(5)溶液應在2℃－8℃下避光保存。

具體使用方法參照培養(yǎng)基包裝袋上的說明書

2、注意事項

1）細胞培養(yǎng)用水一般為三蒸水（經石英蒸餾器蒸餾）或超純水，醫(yī)藥生產上一般為注射用水。

2）建議盡量選擇與所用量相匹配的包裝一次使用，因為包裝一旦打開，組分可能會變質或因受潮而結團。

3）溶解干粉培養(yǎng)基時先加入終體積90％－95％的培養(yǎng)用水，添加劑加完后再補足。

4）如需添加的組分較多時，某一組分溶解后，再添加另一組分。

5）待培養(yǎng)基溶解后再加入碳酸氫鈉，以免產生沉淀。

6）所有成分溶解后，培養(yǎng)基應立即過濾或高壓除菌，以免產生沉淀或有微生物污染。

7）在過濾除菌時，一般情況下應調pH比所需值低0.1～0.2個單位，因過濾除菌后，pH值會升高約0.2。

8）在細胞培養(yǎng)過程中，建議不加或加少量的抗生素，如血清的濃度較低則所加抗生素的量也要相應降低一些。

9）建議用1 N HCl或1 N NaOH來調節(jié)培養(yǎng)基的pH，因為用碳酸氫鈉來調對培養(yǎng)液的滲透壓影響比較大。

三、培養(yǎng)基滅菌

培養(yǎng)基的滅菌方法主要有兩種，高壓除菌及0.22 um微孔濾膜過濾除菌。與過濾相比，高壓滅菌的工作強度小，相對便宜，失敗率低，但易造成營養(yǎng)成分的流失。

1、高壓滅菌

某些培養(yǎng)基（如MEM）可進行高壓滅菌，例如清大天一的MEM培養(yǎng)基中的MD605、MD609等。其中不含有L-谷氨酰胺和碳酸氫鈉，可在高壓滅菌后加入。另外可高壓的谷氨酸鹽（如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）可代替L-谷氨酰胺。

為保證高壓滅菌的效果，滅菌設備的驗證很關鍵，可高壓滅菌的培養(yǎng)基在121℃、15psi，15分鐘的條件下可達到滅菌效果及營養(yǎng)成分的最小損失，因此不需將滅菌時間延長。

2、過濾滅菌

大多數培養(yǎng)基采用0.1～0.2 μm孔徑的微孔濾膜進行過濾滅菌，并且已成為培養(yǎng)基除菌的發(fā)展方向，它可低限度地減少培養(yǎng)基的營養(yǎng)損失。

四、細胞培養(yǎng)液的儲存

細胞培養(yǎng)液的儲存條件一般為2－8℃、密閉、避光保存，但要注意如下幾點：

1）過濾后的培養(yǎng)液，即添加了血清、谷氨酰胺、抗生素等的培養(yǎng)液要盡快使用，一般在2－3周內使用完。培養(yǎng)液中的L-谷氨酰胺是不穩(wěn)定的，不同溫度L－谷氨酰胺的降解。

2）滅菌后的未加L-谷氨酰胺等添加劑的培養(yǎng)基溶液，一般可在4℃保存6～9個月，也可冷凍保存，用時解凍。

3）高壓除菌后的培養(yǎng)基應置4℃保存，不能因為其可耐受高溫而忽略儲存溫度。

4）添加某些生長因子、激素等添加物，可能會改變培養(yǎng)液的儲存條件，比如溫度、時間等方面的要求。

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