線粒體，作為細(xì)胞的“動力引擎”，不僅是細(xì)胞能量生產(chǎn)的核心，還參與物質(zhì)代謝、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種關(guān)鍵過程。線粒體功能的異常與多種疾病密切相關(guān)，如神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、糖尿病等。因此，準(zhǔn)確檢測線粒體的形態(tài)和功能，對于疾病診斷、藥物研發(fā)和健康管理具有重要意義。

Elabscience將帶您深入了解線粒體形態(tài)以及功能檢測的關(guān)鍵指標(biāo)，如膜電位、線粒體復(fù)合物、耗氧量、三磷酸腺苷（ATP）等及其應(yīng)用方法，助您在科研中更好地評估線粒體健康狀態(tài)。

線粒體形態(tài)檢測

線粒體形態(tài)的變化與線粒體功能密切相關(guān)，通常我們可以通過顯微鏡來觀察其二維形態(tài)和數(shù)量。電子顯微鏡則是觀察和分析線粒體結(jié)構(gòu)的“金標(biāo)準(zhǔn)”^[1]。此外，寬視野熒光顯微鏡和高分辨率共聚焦激光掃描顯微鏡能夠提供線粒體形態(tài)變化的成像分析，且特異性高于電子顯微鏡。同時，通過使用特定的染料標(biāo)記線粒體，結(jié)合免疫熒光染色技術(shù)和計算機圖像處理，能夠更清晰地可視化線粒體的形態(tài)。

線粒體功能檢測

線粒體的功能是細(xì)胞活動的基礎(chǔ)，它的功能除物質(zhì)轉(zhuǎn)化以外，最終體現(xiàn)在能量轉(zhuǎn)換上。在評估線粒體功能時，通常會檢測活性氧（ROS）水平、線粒體呼吸鏈復(fù)合物、耗氧量、ATP、膜電位、鈣離子濃度、膜通透性轉(zhuǎn)換孔等一系列指標(biāo)。接下來，我們將針對上述關(guān)鍵指標(biāo)的檢測方法做重點介紹。

1. 膜電位檢測

線粒體膜電位（MMP）對維持細(xì)胞動態(tài)平衡至關(guān)重要。即使是MMP的微小變化，也可能顯著影響線粒體的功能^[2]。當(dāng)MMP發(fā)生異常波動時，可能會引發(fā)一系列線粒體相關(guān)疾病。因此，監(jiān)測MMP是評估線粒體健康狀態(tài)的一個重要手段。

JC-1是一種廣泛應(yīng)用于檢測MMP的陽離子型親脂性熒光探針，其靈敏度高于早期使用的Rhodamine 123。當(dāng)MMP較低時，JC-1以單體形式存在，產(chǎn)生綠色熒光；而在MMP較高時，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中，形成聚合體JC-1，產(chǎn)生紅色熒光。通過使用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀觀察這些顏色變化，科學(xué)家們能夠定量分析線粒體膜電位的變化，從而評估線粒體的功能狀態(tài)。

圖1為使用JC-1試劑盒檢測喜樹堿誘導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞凋亡膜電位變化。

結(jié)果：正常細(xì)胞（左）存在少量凋亡，表現(xiàn)為出現(xiàn)少量線粒體膜電位崩塌細(xì)胞；誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞（中，2.5μM喜樹堿處理Jurkat細(xì)胞24h）出現(xiàn)大量線粒體膜電位崩塌細(xì)胞；CCCP處理細(xì)胞（右，陽性對照）幾乎所有細(xì)胞線粒體膜電位崩塌。

2. 線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性檢測

線粒體呼吸鏈位于線粒體內(nèi)膜上，由5個復(fù)合物組成：復(fù)合物I（NADH-Q氧化還原酶）、復(fù)合物II（琥珀酸-Q氧化還原酶）、復(fù)合物III（UQ-細(xì)胞色素C氧化還原酶）、復(fù)合物IV（細(xì)胞色素C氧化酶）和復(fù)合物V（ATP合成酶）。其通過一系列的氧化還原過程最終形成ATP。線粒體呼吸鏈復(fù)合物酶活力的高低，既反映了ATP生成的能力，也反映出細(xì)胞活力。

常用的線粒體呼吸鏈復(fù)合物檢測方法有分光光度法、蛋白質(zhì)印跡法、近紅外光譜技術(shù)等。其中，分光光度法是評估復(fù)合物I-V活性的主要技術(shù)。為了比較不同細(xì)胞或組織中線粒體呼吸鏈復(fù)合物的活性，需同時測量檸檬酸循環(huán)中檸檬酸合酶的活性作為對照。

具體而言，復(fù)合物I和V的活性與NADH的氧化速率成正比，可通過測量NADH在340 nm處的吸光度來確定。復(fù)合體II催化琥珀酸氧化，以2,6-二氯靛酚（2,6-dichlorophenol indophenols, DCPIP）為底物，可通過測定底物氧化后600 nm處吸光度確定復(fù)合體II的活性。而復(fù)合體III和IV則可以通過測量細(xì)胞色素在550 nm處的吸光度來確定其活性。

圖2. CHO細(xì)胞線粒體復(fù)合物檢測結(jié)果

3. 耗氧率檢測

線粒體是細(xì)胞內(nèi)耗氧最多的細(xì)胞器。通過實時監(jiān)控細(xì)胞中的線粒體呼吸耗氧率（OCR），可以有效評估線粒體的氧化磷酸化效率及能量代謝狀態(tài)。OCR降低通常指示線粒體ATP合成受損或存在功能障礙，而OCR的升高則表明細(xì)胞活動旺盛且代謝速率加快。這種方法廣泛應(yīng)用于藥物篩選、疾病模型研究以及細(xì)胞代謝狀態(tài)的評估。

傳統(tǒng)的氧電極極譜法雖然能夠檢測線粒體耗氧量，但操作較為復(fù)雜。近年來，隨著技術(shù)的進(jìn)步，多種自動或半自動化的線粒體功能分析儀問世，但由于儀器價格較高，仍未完 quan普及。為了解決這一問題，我們推出了可在熒光酶標(biāo)儀上檢測OCR的試劑，為研究者提供了更便捷、經(jīng)濟的解決方案。

圖3. Hela細(xì)胞OCR檢測結(jié)果

圖3為使用OCR試劑盒檢測2μM FCCP和0.5μM AntimycinA處理的Hela細(xì)胞。

結(jié)果：FCCP處理后OCR增加，AntimycinA處理后OCR降低。

4. ATP含量檢測

ATP通常被認(rèn)為是細(xì)胞的主要能量來源，而線粒體是ATP的主要生產(chǎn)場所。線粒體對外界環(huán)境刺激非常敏感，一旦受損會導(dǎo)致ATP生成減少，進(jìn)而抑制多種細(xì)胞代謝過程，最終可能引發(fā)各種疾病。例如，帕金森病、心血管疾病和內(nèi)分泌功能障礙等均與線粒體ATP產(chǎn)量下降密切相關(guān)^[3,4]。因此，ATP水平是評估細(xì)胞能量代謝和線粒體功能的關(guān)鍵指標(biāo)。

測量ATP水平需要新鮮提取的線粒體樣品，以保 證線粒體的完整性和連接狀態(tài)^[5]。目前常用的技術(shù)包括經(jīng)典層析法、高效液相色譜法、酶分析法和熒光檢測法等。其中，熒光素–熒光素酶測定法是一種被廣泛使用的方法，其檢測靈敏度能到達(dá)nmol甚至更低。

圖4為使用ATP/ADP檢測試劑盒檢測Camptothecin處理后的Jurkat細(xì)胞變化。

結(jié)果：Camptothecin處理后ATP/ADP比值降低。

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參考文獻(xiàn)

[1] Granata, C., Jamnick, N.A. and Bishop, D.J. Training-Induced Changes in Mitochondrial Content and Respiratory Function in Human Skeletal Muscle. Sports Medicine, 2018, 48, 1809-1828.

[2] Chen LB. Mitochondrial membrane potential in living cells. Annu Rev Cell Biol, 1988, 4: 155-181.

[3] Lee, P., Chandel, N.S. and Simon, M.C. Cellular Adaptation to Hypoxia through Hypoxia Inducible Factors and Beyond. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2020, 21, 268-283.

[4] 張鑫, 黎萍, 王鈺涵, 等. 血管性癡呆認(rèn)知功能障礙與海馬線粒體功能異常的機制研究進(jìn)展[J]. 中國全科醫(yī)學(xué), 2022, 25(23): 2910-2916.

[5] Sch?nfeld, P. and Wojtczak, L. Short- and Medium-Chain Fatty Acids in Energy Metabolism: The Cellular Perspective. Journal of Lipid Research, 2016, 57, 943-954.