甲基柠檬酸合酶（metheyl-citrate synthase，MCS）试剂盒说明书

微量法 100 管/96 样

甲基柠檬酸合酶试剂盒 三羧酸

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

MCS 广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中，与柠檬酸合酶（CS）共同参与三羧酸循环的调节。

测定原理：

MCS 催化丙酰CoA 和草酰乙酸产生甲基柠檬酰辅meiA，进一步水解产生甲基柠檬酸；该反应促使无色的DTNB 转变成黄色的TNB，在 412nm 处有特征吸光值。

组成：

试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存，临用前加入 1ml 蒸馏水，用不完的试剂仍-20℃保存；

自备仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1ml 试剂一和 10μl 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。将匀浆 600g，4℃离心 5min。

弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。

上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 CS（此步可选做）。

在步骤④的沉淀中加入 200μl 试剂二和 2μl 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体 CS 测定。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 412nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

在试剂五中加入 1ml 无水乙醇和 22ml 试剂四，混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 样本、220μl 试剂五和 10μl 试剂六，混匀，记录 412nm 处20 秒时的初始吸光度A1 和 2 分 20 秒时的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。

MCS 活性计算：

使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。 MCS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=880×ΔA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

按样本鲜重计算：

单位的定义：每g 组织每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

MCS（nmol/min /g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（W× V 样÷V 样总）÷T=177.8×ΔA÷W

按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

MCS（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（500×V 样÷V 样总）÷T=0.3556×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2.4×10-4 L；ε：TNB 摩尔消光系数，1.36×104 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm； V 样：加入样本体积，0.01 ml；V 样总：加入提取液体积，0.202 ml；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。

使用 96 孔板测定的计算公式如下：

按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。 MCS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1760×ΔA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

按样本鲜重计算：

单位的定义：每g 组织每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

MCS（nmol/min /g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（W ×V 样÷V 样总）÷T=355.6×ΔA÷W

按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

MCS（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（500×V 样÷V 样总）÷T=0.711×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2.4×10-4 L；ε：TNB 摩尔消光系数，1.36×104 L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm； V 样：加入样本体积，0.01 ml；V 样总：加入提取液体积，0.202 ml；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。

甲基柠檬酸合酶试剂盒 三羧酸