影響ELISA試劑盒 測(cè)定結(jié)果的因素主要包括以下幾點(diǎn):
( 1) 抗原包被的質(zhì)量。將抗原固定于聚苯乙烯微量反應(yīng)板中稱之為包被, 其效果好壞是影響抗原?? 抗體反應(yīng)的重要因素;
( 2) 非特異性反應(yīng)干擾的排除。除了設(shè)置稀釋液空白、陽(yáng)性和陰性參比血清等對(duì)照外, 可采用包埋、封閉等預(yù)處理, 如在包被液中加入牛血清白蛋白、明膠或吐溫- 20 等, 以減少非特異性反應(yīng)的發(fā)生。高選擇性的單克隆抗體代替多克隆抗體也是提高ELISA 特異性的另一有效途徑[ 3] 。此外, 選擇表面積較大的固相載體, 也有利于提高ELISA 的敏感性;(3) 酶和交聯(lián)劑的選擇。用于ELISA 標(biāo)記的酶, 主要有辣根過(guò)氧化氫酶(HRP) 、堿性磷酸酯酶(AKP) 、葡萄糖氧化酶( GO) 和半乳糖苷酶等, 而以HRP 用得較多。酶和抗體交聯(lián)可用免疫法( 酶-抗酶抗體) 或化學(xué)法, 常用化學(xué)法。一般來(lái)說(shuō), HRP與抗體的交聯(lián)現(xiàn)多采用改良Wilson?? s 法( 高碘酸鈉
氧化法) , AKP 與抗體交聯(lián)通常有戊二醛法和偶氮法[ 3] ;( 4) 酶底物。它本身要求無(wú)色, 反應(yīng)后能穩(wěn)定呈色。一般HRP 常采用鄰苯二胺( 產(chǎn)物桔黃色, 可穩(wěn)定呈色數(shù)小時(shí)) 或鄰聯(lián)甲苯胺作酶底物; AKP 常用對(duì)硝基苯磷酸鹽作酶底物。
2?? 酶聯(lián)免疫吸附在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用
2. 1 ?? 細(xì)菌的檢測(cè)
檢測(cè)方法( 薄層層析法TLC、放射免疫分析法RIA、液相色譜法HPLC)進(jìn)行了對(duì)比研究。結(jié)果表明直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 及間接競(jìng)爭(zhēng)LISA 具有靈敏、特異、簡(jiǎn)便、快速、安全、價(jià)廉等特點(diǎn), 適合在我國(guó)基層推廣應(yīng)用。路戈等[ 14] ( 1996 年) 利用抗AFB1 的單克隆抗體建立了檢測(cè)食品( 玉米、花生、小麥、大米、植物油) 中AFB1 的ELISA 間接競(jìng)爭(zhēng)法。該方法zui低檢出濃度為0. 0lng/ g, 敏感范圍為0. 2~ 50ng/ g, 平均回收率為83. 0~ 110. 3%, 精密度為2. 0~ 24. 3%。用該法測(cè)定了分布于淮河以北地區(qū)的1455 份樣品, 并對(duì)25 份植物油樣品用TIC 和ELISA 兩種方法進(jìn)行了對(duì)比測(cè)定。結(jié)果表明, 在方法靈敏度下( 5ng/ g ) TLC 均無(wú)AFB1 檢出, 而ELISA 法AFB1 檢出率為96%, ELISA法的檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)高于TLC 法。黃薇等[ 15]( 2002年) 運(yùn)用ELISA 并使用試劑盒對(duì)292 份樣品進(jìn)行了黃曲霉素B1 的檢驗(yàn), 并與薄層法進(jìn)行了比較。結(jié)果表明: 回收率為72% ~ 95% , 變異系數(shù)為2. 76% , 與薄層法相比, 該法快速、簡(jiǎn)便、靈敏、安全。用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)食品中赭曲霉毒素A的方法, 也有綜述性介紹[ 16] 。