近年來，免疫療法作為一種新的癌癥治療方式引起研究者的廣泛關(guān)注。在新近開發(fā)的癌癥免疫治療技術(shù)中，嵌合抗原受體修飾的T細胞（CAR-T）技術(shù)備受青睞。從1989年*代CAR-T開發(fā)至今，基于CAR-T的癌癥免疫治療取得了重大進展。數(shù)十項CAR-T臨床試驗正在范圍內(nèi)進行（圖1）。為了構(gòu)建CAR-T，向T細胞內(nèi)導入編碼識別癌癥抗原單鏈Fv（scFv）的融合蛋白基因，與T細胞受體的細胞內(nèi)信號傳導結(jié)構(gòu)域相連。
根據(jù)T細胞受體的細胞內(nèi)信號傳導域數(shù)目，CAR-Ts分為*代，第二代和第三代（圖2）。*代CAR-T細胞被設(shè)計為在細胞外表達scFv，并且T細胞受體胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域沒有共刺激分子表達。但*代CAR-Ts通過特異性抗原識別腫瘤細胞后，其對腫瘤細胞的殺傷力不足。為了克服這些缺陷，第二代和第三代CAR-Ts被設(shè)計為在細胞內(nèi)表達共刺激分子（圖2）。第二代CAR-Ts的嵌合抗原受體（CAR）基因框架包含一種共刺激分子，如CD28或4-1BB。第三代CAR-Ts進一步發(fā)展為包括CD27，CD28，4-1BB和OX40在內(nèi)的兩種共刺激分子。
CAR-T的制備和給藥
CAR-Ts通過三個連續(xù)步驟制備（Lee et al.2012； Wang and Riviere 2015； Levine 2015）。*步是構(gòu)建CAR的基因框架，用于編碼與T細胞受體的信號序列連接的腫瘤抗原特異性Fv。第二步，用病毒、非病毒或物理方法將CAR導入T細胞。逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒是成功應用于CAR導入T細胞的病毒載體。也有研究通過電穿孔將編碼CAR的質(zhì)粒DNA或RNA導入T細胞。第三步是培養(yǎng)CAR-T細胞。
有幾種方法試圖激活T細胞以利于轉(zhuǎn)染，其中之一是使用抗CD3抗體和細胞因子，如白細胞介素2。其他T細胞激活方法正在研究階段（圖3）。表達4-1BBL和Fc受體的抗原呈遞細胞也被用于激活T細胞。另一種方法使用經(jīng)抗CD3和抗CD28抗體修飾的珠子進行T細胞活化。CAR-T細胞來源于CD4或CD8 T細胞，使用細胞因子擴增，并通過靜脈回輸給患者。
圖3 T細胞的活化和CAR-T的擴增
CAR-T對比現(xiàn)有免疫療法治療癌癥的優(yōu)勢
CAR-Ts相較于單克隆抗體和抗體-藥物聯(lián)合用藥，其對抗終末期癌癥的有效性引起研究者的廣泛關(guān)注。另外，CAR-Ts作用機制與T細胞受體工程T細胞（TCR-T）不同。TCR-T中，TCR識別在APC細胞中加工并與MHC分子共同表達于APC細胞表面的腫瘤抗原復合物。與TCR-T不同，CAR-Ts對腫瘤抗原識別不需要對抗原進行加工和表達，不需要用MHC分子參與（；圖4）。表1總結(jié)了CAR-T和TCR-T之間的差異。值得注意的是，缺乏MHC限制意味著適用CAR-T的患者比TCR-T更廣，TCR-T治療需要鑒定患者的MHC類型。
CAR-T研究現(xiàn)狀
CAR-T已經(jīng)應用于治療淋巴癌和實體腫瘤的多個研究中，涵蓋細胞水平（表2；圖5）、動物水平（表2；圖5）、臨床前（表3；圖5）和臨床研究（表4；圖6）。CAR-T基礎(chǔ)研究階段狀況顯示，在CAR基因?qū)隩細胞時應用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的。雖然病毒載體的使用占據(jù)主導，但陽離子聚合物或電穿孔等非病毒轉(zhuǎn)染方法已經(jīng)嘗試過（圖）。淋巴癌等血癌已成為CAR-T基礎(chǔ)研究階段的主要治療目標（圖5b）。第二代CAR-Ts已成為基礎(chǔ)細胞水平和動物水平研究zui廣的領(lǐng)域，主要針對血癌和實體腫瘤（圖5c）。CAR-T應用已經(jīng)從癌癥免疫治療擴展到自體免疫疾病治療，如歐洲的多發(fā)性硬化癥。另一項研究報告指出CAR-T治療真菌感染的新領(lǐng)域。同本研究相似，臨床前研究中，構(gòu)建第二代CAR和利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的頻率均高于其他類型CAR（圖5f）和病毒載體（圖5d）。值得注意的是，血癌臨床前研究低于腦癌（圖5e）。
將CAR-T基因?qū)隩細胞，病毒載體占主導地位。報道稱體內(nèi)CAR-T存活時間長達幾個月。由于CAR持續(xù)表達可引起不良反應，因此*表達時長需要進一步研究。為縮短CAR表達持續(xù)時間并降低安全隱患，正在進行物理電穿孔轉(zhuǎn)染研究。通過電穿孔導入T細胞細胞質(zhì)的編碼CAR的質(zhì)粒DNA連續(xù)數(shù)天表達，可避免轉(zhuǎn)染載體引起的不良反應。
目前，有超過80個CAR-T項目正在進行臨床研究（www.clinicaltrials.gov）。目前還沒有項目進入Ⅲ期臨床，但鑒于Ⅱ臨床數(shù)據(jù)（表4），獲準可能性很高。CAR-T的大部分臨床研究在美國進行，部分在中國和日本開展（圖1）。作為CAR-T的腫瘤抗原靶點，CD19被廣泛研究，其在急性淋巴細胞性白血病（ALL）患者的白血病細胞表面上超表達。報道稱，CD19 CAR-T對骨髓移植后復發(fā)性ALL患兒有效（Lee et al.2015）。臨床研究的產(chǎn)品中，針對ALL的CTL019（Novartis，美國）、CD19靶向CAR-T（CD19-CAR-T）被美國食品和藥物管理局認定為“突破性療法”，正處于Ⅱ臨床階段。其他幾家制藥公司也開發(fā)CAR-T產(chǎn)品。臨床研究中，CD19已被廣泛用作血液癌癥的靶抗原（圖6a）。其他靶抗原包括癌胚抗原（CEA）、人表皮生長因子受體2（HER2）、GD2、CD30和CD20（圖6a）。血液癌癥是臨床研究的主要方向（圖6b）。目前為止，Ⅱ臨床是CAR-Ts研究的zui快階段（圖6c）。
挑戰(zhàn)
每一代CAR-T的限制
盡管CAR-T利用了T細胞殺傷異常細胞的免疫反應，但對實體腫瘤細胞的殺傷力較弱。其抗腫瘤活性降低歸因于腫瘤組織微環(huán)境的免疫抑制作用，導致CAR-T對實體瘤的滲透效率降低。而且，腫瘤中的白細胞分泌的細胞因子降低了T細胞活性。
第二代CAR-Ts含有的共刺激信號結(jié)構(gòu)域可誘導免疫抑制受體如T細胞膜蛋白-3、細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）和細胞凋亡-1（PD-1）。為了克服PD-1對CAR-T的活性抑制，正在研究抗PD-1抗體與CAR-T聯(lián)合使用的效果。一項臨床研究（NCT00586391）正在探索CAR-T和抗CTLA-4抗體ipilimumab聯(lián)合使用的效果。
具備兩種共刺激分子如OX40和4-1BB的第三代CAR-Ts在體內(nèi)活性增強。然而，兩種共刺激分子對T細胞活性的過度刺激可誘導細胞因子分泌的突然增加，稱為“細胞因子釋放綜合征”（CRS）。這種嚴重的不良反應是CAR-T開發(fā)過程中需要解決的zui大安全問題之一。
不良反應
CAR-T臨床研究zui大的障礙是其嚴重的不良反應，其中CRSzui為嚴重。接受CAR-T臨床試驗的患者的死亡率突顯臨床方案設(shè)計改進的和新藥開發(fā)監(jiān)管的必要性。CRS的癥狀包括高熱、關(guān)節(jié)疼痛、肌肉疼痛、低血壓和呼吸困難，少數(shù)病例死亡。2014年，兩名患者接受Juno Therapeutics公司（美國）CD19-CAR-T治療后兩周內(nèi)死亡，此項在Memorial Sloan Kettering癌癥中心進行的臨床研究被迫中止。迄今為止，CRS已被確定為臨床試驗中患者死亡的主要原因。
盡管CRS是CAR-T療法zui常見的不良反應，但CRS的進程也被認為與治療作用相關(guān)。早期研究發(fā)現(xiàn)，對CAR-T治療有反應的患者會發(fā)生CRS，而對治療無反應的患者不發(fā)生CRS。CRS的嚴重程度與接受CAR-T治療時的腫瘤負荷相關(guān)。鑒于CRS在臨床監(jiān)測中的重要性，需要確定能夠預測CRS嚴重程度的標志物。研究發(fā)現(xiàn)，重度CRS中干擾素-γ的峰值水平比在輕度CRS中更高。其他研究提出C反應蛋白可作為嚴重CRS的標志物。然而，CRS的決定性生物標志物仍有待研究。
為盡量減少不良反應，臨床方案設(shè)計中甄選患者和優(yōu)化CAR-T劑量至關(guān)重要。目前通過抗白介素-6抗體或類固醇藥物與CAR-T聯(lián)合使用以減少CRS，這方面還需要進一步的研究。此外，評估CAR-T是否能誘導自身免疫或移植物排斥宿主等安全性研究也尤為必要。一些研究評估了細胞因子抑制劑或zi殺基因與CAR-T聯(lián)合給藥減少CRS的功效。zui近的一項研究報道，CAR-T與抗白細胞介素-6抗體tocilizumab聯(lián)合給藥可緩解CRS。
大多數(shù)臨床研究使用病毒載體轉(zhuǎn)染CAR基因，用于CAR-Ts的構(gòu)建。盡管這些載體被改造為的，但應該對其潛在復制能力進行長期（多年）監(jiān)測。CAR-T給藥后對細胞因子的分析和標準化是必要的。2014年兩名患者的死亡表明CRS是CAR-T臨床研究中zui嚴重的缺陷。CAR-T細胞體內(nèi)擴增引起細胞因子過度分泌，并且可能導致死亡。為了監(jiān)測和控制CRS，確定細胞因子的特定作用和相關(guān)細胞因子的類型有助于預測臨床研究中的CRS風險。此外，臨床研究期間細胞因子和CRS標記細胞因子的分析應該標準化。
在CD19-CAR-T案例中，抗癌作用伴有一定程度的不良反應。探索CAR-T療效與不良反應相分離的可能性，旨在建立CRSzui小化的給藥方案。CAR-T的自身免疫是另一個潛在的問題。低劑量的CAR-T和單一CAR-T的系列腫瘤細胞殺傷作用可降低自身免疫發(fā)生的可能性。然而，CAR-T的人工構(gòu)建性質(zhì)可能增加其自身免疫的風險。因此，為確保安全，對自身免疫問題的監(jiān)管不應忽視。
除了CRS，另一個值得關(guān)心的不良反應是“脫靶”。此類不良反應是由于CAR-Ts的大多數(shù)靶抗原共同存在于腫瘤和正常組織上，只是在腫瘤細胞過度表達。為將“脫靶”的不良反應降至zui低，尋找僅在腫瘤細胞表達的新靶分子是必要的。另一種途徑是去除非適當激活的CAR-Ts。zui近的一項研究報道，小分子藥物AP1903可以在轉(zhuǎn)染的細胞中誘導caspase 9和細胞凋亡，只殺死表達高水平CAR的活化細胞。
監(jiān)管
美國諾華公司（Novartis）設(shè)計的CD19-CAR-T CTL019是*個進入Ⅱ期臨床研究的CAR-T類化合物。從監(jiān)管角度看，CAR-T制備和臨床研究是主要關(guān)注的問題。制備問題包括CAR-T產(chǎn)品的一致性、患者依賴的T細胞轉(zhuǎn)染效率、適宜CAR轉(zhuǎn)染的*T細胞類型以及CAR-T標記。臨床研究主要關(guān)注效力和安全性。
CAR-T的藥代動力學和生物分布
藥代動力學和生物分布實驗為預測CAR-T可能存在的不良反應提供了必要信息。zui近的一項研究報道，CAR-T經(jīng)靜脈內(nèi)給藥后分布到骨髓，在血液中循環(huán)中持續(xù)存在10個月以上。進一步定量分析藥代動力學、體內(nèi)組織分布和保留是*的。腫瘤抗原HER-2在腦組織和乳腺中表達；在結(jié)腸或正常組織中鑒定出了另一種腫瘤抗原—癌胚抗原；腫瘤抗原在正常組織中的非特異性表達增加了CAR-T對正常組織損傷的可能性。從這些角度看，與CAR-T的分布和藥代動力學相關(guān)的監(jiān)管問題有待解決。
CAR-T效力
與CAR-T效力相關(guān)的一個關(guān)注點是挑選合適的T細胞亞群。臨床研究中大多數(shù)CAR-Ts是從患者全部T細胞中分離導入CAR基因的T細胞獲得。T細胞亞型是否影響CAR-Ts的轉(zhuǎn)染效率和效力還需進一步研究。
CAR-T效力評估方法需進一步探索。目前CAR-Ts的誘導腫瘤細胞溶解和細胞因子分泌能力處在研究階段。建立評價CAR-T效力的相關(guān)方法有助于對CAR-T產(chǎn)品進行標準化評估。此外，由于CAR-T在體內(nèi)擴增，有必要評估CAR-T占總T細胞的比率、CAR拷貝數(shù)和效力之間的相互。
不同于化學藥物或蛋白質(zhì)藥物，CAR-T是一種活性藥物，給藥后可在體內(nèi)擴增。這種擴增導致CAR-T的實際有效劑量增加。癥狀嚴重程度和患者年齡可能是影響CAR-T體內(nèi)擴增效率的因素。給藥劑量和實際發(fā)生效用劑量之間存在差異是CAR-T的*特征。進一步分析給藥劑量、效用劑量和治療效果之間的關(guān)系是必要的。
需要鑒定出具備抗癌活性的特定T細胞亞型。目前，CAR-T給藥是各種T細胞亞群的混合物。 zui近的一項研究表明，在動物模型中，增加zui接近記憶性T細胞干細胞的CD8（+）CD45RA（+）CCR7（+）的CAR-T比例，抗癌活性增強。
CAR-T的臨床研究
幾個關(guān)于CAR-T*劑量的問題需要澄清。由于靜脈輸注的CAR-T在體內(nèi)擴增，初始劑量與實際發(fā)揮效用的劑量不同。另外，劑量的調(diào)整標準應該依據(jù)患者的體重和體表面積?？紤]到輸注后分布至骨髓的CAR-Ts的擴增，我們需要確定測量所得血液中CAR-T數(shù)量是否反映骨髓中CAR-T的擴增。
CAR-T產(chǎn)品的制造和質(zhì)量控制
為了驗證CAR-T批間質(zhì)量一致性，藥品制造和控制（CMC）至關(guān)重要。對CAR-T生產(chǎn)的每一步實施質(zhì)量控制十分必要（圖7）。通過質(zhì)量控制，保持CAR轉(zhuǎn)染效率的批間一致性，質(zhì)控參數(shù)包括基因修飾的CAR-T占總T細胞比例的可接受范圍和單個細胞CAR基因拷貝數(shù)量。為了持續(xù)穩(wěn)定的生產(chǎn)CAR-T，需要提供標準化的轉(zhuǎn)染和增殖穩(wěn)定的病毒載體。此外，應該評估患者年齡和用藥史對CAR轉(zhuǎn)染T細胞的影響。
病毒載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或慢病毒載體經(jīng)常用于將CAR導入T細胞。應從純度、安全性、T細胞轉(zhuǎn)染效率和物理化學特性等方面對轉(zhuǎn)染CAR基因的病毒載體進行質(zhì)量控制。
此外，質(zhì)控中CAR-T無菌驗證*。由于CAR-T是由離體T細胞制備的，期間經(jīng)過CAR基因的導入和擴增，需要建立CAR-T的無菌檢查和微生物限度。
CAR-T的生產(chǎn)和分配需要標準化。經(jīng)過理論設(shè)計和驗證之后，大部分生產(chǎn)工藝從實驗室轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)車間。攜帶CAR的病毒載體和CAR-T的制造過程復雜且在之間存在差異。臨床研究使用的CAR-T產(chǎn)品經(jīng)不同的生產(chǎn)和分配方案到達患者?；蛐揎椉毎纳a(chǎn)和分配過程對質(zhì)量影響至關(guān)重要。制造和分配的質(zhì)量控制和標準化應以實踐為指導。
CAR-T產(chǎn)品的標簽應仔細核對。由于CAR-T的自體性質(zhì)，CAR基因轉(zhuǎn)染患者T細胞并將其回輸至同一患者，標識明確對zui小化CAR-T在非自體患者體內(nèi)擴增的潛在致命風險至關(guān)重要。
結(jié)論
CAR-Ts作為一種新型且有效的癌癥免疫療法吸引了眾多研究者的關(guān)注。制藥公司已經(jīng)開始投資CAR-Ts，有幾個產(chǎn)品正在審批中。對CAR-T的監(jiān)管問題也需關(guān)注。具備活性的CAR-T需要嚴格評估其安全性和有效性。CAR-T的離體制造過程突出了無菌驗證和全面產(chǎn)品質(zhì)量控制的重要性。下一步，嚴格監(jiān)管和制定科學的監(jiān)管指導方針將會加快開發(fā)安全有效CAR-T產(chǎn)品的進程，惠及患者。(生物谷Bioon.com）
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