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干货分享|热启动酶耐热机制全面解析
常规PCR技术因能够快速扩增任何已知的DNA///片段而被广泛应用于分子生物学的各个领域。但常规型PCR技术容易出现引物二聚体或错配引起的非特异性扩增等现象，造成实验结果的不准确性。热启动型PCR能够很好的解决上述问题，是常用的提高PCR特异性的方法。
热启动酶介绍
热启动酶（Hot start enzyme）主要利用酶的修饰物在常温下抑制DNA聚合酶的活性，加热至变性温度时修饰物失活，释放酶活，从而使PCR反应得以正常进行。目前市面上常用的DNA聚合酶热启动修饰方法主要有化学修饰、配体修饰和抗体修饰等，不同的热启动修饰方法原理上有所区别，各有优劣势。
化学法
DNA聚合酶的化学法修饰，一般采用化学小分子如酸酐等有机物与聚合酶上的侧链氨基酸（赖氨酸）通过化学反应相互作用，使酶低温时失去酶活，温度升高后，酸酐与氨基之间的化学键断裂，酶活释放，从而达到热启动效果。化学修饰可有效封闭酶的活性，操作简单，但酶活性释放速度较慢，依赖温度激活DNA聚合酶，能有效抑制非特异性产物，可在室温下配置反应体系，且对PCR反应buffer要求较高。
图1：化学法修饰热启动酶原理图
配体法
配体法修饰，主要借助核酸适配体封闭酶活。顾名思义，核酸适配体一般指一类具有特异性识别功能的单链核酸分子，可以是RNA也可以是DNA，长度一般为25～60个核苷酸。作为一种寡核甘酸序列的识别分子，作用的靶分子范围广泛，从无机金属的小分子到生物领域的大分子。这些适配子可以形成特定的空间构象，从而在表观功能上与抗体类似。对蛋白质或其他小分子物质具有高度特异性、亲和力。核酸适配体通过非共价键与DNA聚合酶结合，进而抑制聚合酶在非许可温度下的聚合反应。一般核酸适配体的筛选所需周期较短，整个过程能够依赖自动化，简便快捷。
图2：配体法修饰热启动酶原理图
抗体法
抗体法热启动酶一般考虑使用DNA聚合酶抗体封闭酶活性，使其在低温时处于无活性状态，在加热至变性温度时抗体变性，解除封闭从而释放活性，可以大大避免错配或引物二聚体引起的非特异性扩增。另一方面针对低丰度基因，封闭抗体在避免预变性前的DNA聚合酶和模板的非特异性结合的同时，增加了引物与微量的正确模板碰撞退火的效率，从而保证低丰度基因的有效检出，大大提升反应灵敏度和扩增效率。
图3：抗体法修饰热启动酶原理图
表1：热启动酶常见修饰方法优劣势比较
酶活封闭类型 | 化学修饰 | 配体修饰 | 抗体修饰 |
原理 | 化学小分子和DNA聚合酶活性中心结合封闭酶活 | 核酸适配体通过非共价键作用与聚合酶结合封闭酶活 | DNA聚合酶抗体与聚合酶结合封闭酶活 |
酶活释放条件 | 温度：大于95 ℃ 时间：10-15 min | 温度：大于60 ℃ 时间：1-5 min | 温度：大于70 ℃ 时间：30 s-5 min |
优点 | 酶活性维持更加稳定且无任何外源DNA污染，性价比较高。 | 不需要激活步骤，稳定性高，减少样品降解的可能性。 | 酶激活时间短，保证酶活，亲和力强，灵敏度高。 |
缺点 | 酶激活时间较长可能会影响酶的活性，导致PCR产物的产量降低。 | 核酸配体是一种可逆抑制剂，不如化学修饰法稳定，特异不够强。 | 抗体修饰是一种动态平衡，抗体生产成本高，试剂配比优化时间长。 |
以上简单介绍了热启动酶的常见类别和各种热启动方法的优劣势，其中化学修饰物不能够批量合成，而且需要较长的激活时间聚合酶才能释放酶活。配体修饰DNA聚合酶只在20-25°C效果较好，到40°C时，聚合酶的活性就被释放出来，特异性不好；而抗体法修饰热启动酶对应的封闭效果佳，酶活释放速度快，从而大大降低PCR反应时间，是目前IVD市场上应用较多的一种热启动酶改造方法。
热启动酶应用
热启动酶在热启动PCR的应用方面较为广泛，不仅有效防止非特异性PCR产物，而且在较难扩增的PCR反应如单拷贝基因的扩增、多重PCR和超长片段的扩增等应用尤为突出，大大改观了传统PCR技术的局限性。在病原微生物检测、遗传病诊断和法医鉴定等各个领域等实际应用中颇为广泛。在应对爆发的新guan疫情方面，热启动酶亦贡献颇多。目前市面上应用于SARS-Cov-2的一步法RT-qPCR检测试剂的核心酶基本都是抗体法热启动酶。
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参考文献
【1】Michael R. Green, Joseph Sambrook. Hot Start Polymerase Chain Reaction (PCR)[J]. 2018, 2018(5):pdb.prot095125.
【2】Kermekchiev, M. B . Cold-sensitive mutants of Taq DNA polymerase provide a hot start for PCR[J]. Nucleic Acids Research, 2003, 31(21):6139-6147.
【3】Chou Q , Russell M , Birch D E , et al. Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copy-number amplifications[J]. Nucleic Acids Research, 1992, 20(7):1717-1723.
【4】刘峰涛,柴立辉,马远方.DNA聚合酶适配子6-10提高定量PCR的特异性[J].临床检验杂志,2009,27(03):164-166.
