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上海宝叶生物科技有限公司
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[方法]
1．配制PCR“主混合液”，每克隆20ul PCR混合液， 包含：
● 水，15．5ul
● 10XRT缓冲液，2．0ul
● 5mmol／L dNTP， 1．0ul
● 5，引物，1．0ul
● 3，引物，1．0ul
● Taq聚合酶，0.2ul
如果PCR缓冲液中不含Mg2+，这应加至终浓度为1．5mmol／L。也可以使用与DNA聚合酶配套供应的PCR试剂。
2．取20fLl主混合液加到0．5m1管内，或加入96孔PCR微孔板孔内。
3．用l根牙签轻轻接触单个克隆并在PCR反应液中转动，注意不要转移太多材料。如在PCR反应液中有过量细菌，会抑制PCR反应。扔掉牙签；或如有需要，用它在1个单独的96孔培养孔板内培养基救援该克??；或者在琼脂平板上接触表面。用1～2ul甘油储存料或主板培养液，也可以代替相应克隆。
4．反应液上铺上矿物油。
5．用PCR仪格内加热试管或孔板至94℃，10分钟。裂解细菌使其释放模板DNA。然后，以94℃1分钟、55～60℃1分钟（对于Fab片段文库的筛选则为2分钟）、72℃ 1分钟的条件孵育，共循环30次。
6．建议在PCR后取5ul PCR反应产物在2％琼脂糖胶上检测。这将显示有多少克隆包含全长的插入序列。
7．PCR后，在矿物油下面加入20ul主混合液，成分如下：
● 乙?；疊SA（10mg／ml）， 0．2ul
● BstNⅠ缓冲液（10×），4．0ul
● 水，15．3ul
● BstNⅠ （10U／ul），0．54ul
8．60℃孵育样本2～3小时。
9．将2ul样本染液与8ul反应混合物（取自矿物油下面）混合并在4％Nusieve琼脂糖胶上电泳；此胶用含0．05ug／ml溴化乙锭的0．5倍TBE缓冲液配制?；蛘呤怯?．5％琼脂糖胶电泳（此胶的分辨率较低）。
10．以100V（10V／cm）跑胶并在UV transillu minator上比较各种不同的单独克隆的带型。
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