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琼脂糖胶体电泳 (agarose gel electrophoresis)

2013-2-21  阅读(1445)

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仪器用具:
迷你电泳槽及铸胶器 (Mupid II);UV transilluminator 及影像分析系统;防护面罩

药品试剂:
琼脂糖粉末 (agarose, low EEO)
1×TAE电泳缓冲液 (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA, pH 8.0):
由50×TAE (每1 L含242 g Tris base, 57.1 mL glacial acetic acid, 100 mL的0.5M EDTA-8.0) 稀释使用。
10×追踪染剂 (0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol, 0.1 M EDTA, 50%glycerol)
Ethidium bromide (EtBr) stock solution:500 μg/mL,装于滴瓶中,每50 mL胶体溶液加一滴 (zui终浓度为0.5 μg /mL)
DNA 标准分子量:
DNA/HindIII fragments:包含8 个片段23.1, 9.4, 6.5, 4.3, 2.3, 2.0, 0.56, 0.125kb ,浓度为0.5 μg/μL,以下简称 λMr。
1 Kb DNA Ladder Fragments: 250 bp~10 kb共14 个DNA片段,浓度为0.5 μg/μL,以下简称LadMr。

方法步骤:
1) 每组制备一片12-well 1.2% agarose gel: 秤取适量agarose 粉末,加入1×TAE(大片Mupid II 胶片约需40 mL),以微波爐加热溶解后,置55℃水浴降温。
◆ Ethidium bromide 为突变剂,以下操作请务必戴手套,并禁止戴着手套的手到处亂摸!
2) 加入EtBr (每50 mL 胶体溶液加一滴stock solution),混合均匀,将胶体溶液倒入铸胶模,插上样本梳。置室温凝结后,小心拔开样本梳,将胶片置于电泳槽中,倒入1×TAE,直至溶液盖过胶片。
3) 样品DNA 及DNA 标准分子量各加入1/10 体积的10×追踪染剂。将样品及λMr 置65℃水浴5~10 min,移至冰浴降温后,即可加入胶片的样品槽。
◆ LadMr 请勿加热!
4) 以50V 或100V 进行电泳,待追踪染剂bromophenol blue 行进至胶体三分的二处时,关闭电源,取出胶片,以UV transilluminator box 观察色带位置,并照相记录结果。
◆ 请务必戴防护面罩,以免受到UV 伤害。
5) 与标准分子量比较,估计各DNA 片段的分子量并建立质体pBluescript 的限制图谱。
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