細(xì)胞表面IL-2R（mlL-2R）的測定

    白介素2受體（interleukin 2 receptor，IL-2R）由。、p兩條鏈組成。單獨的IL-2Ra為低親和力受體，單獨的IL-2即為中等親和力受體，而雙鏈的IL-2Rop則具有高親和力。Hut-102細(xì)胞可自發(fā)釋放大量可溶性IL-2R（slL-2R），這些受體的檢測對免疫學(xué)研究和某些疾病發(fā)病機(jī)理的探討均有重要意義。

  1．¹²⁵I-rlL-2放射受體分析

  （1）rlL-2的標(biāo)記：常用的核素為¹²⁵I，可使用氯胺T氧化法、乳過氧化物酶標(biāo)記法和Iodogen標(biāo)記法等。

    （2）lzsI_IL_2與受體的結(jié)合：待測細(xì)胞[106／（100ul·管））經(jīng)洗滌后加入不同濃度的¹²⁵I-IL-2（5 000～50000dpm／管），對照管加入100倍量的未標(biāo)記IL-2，總反應(yīng)體積為200uL，37~C孵育20min后立即置冰浴，加入含0．3％BSA預(yù)冷的Hanks液終止結(jié)合。

    （3）離心分層法分離結(jié)合（B）及游離（F） ¹²⁵I-IL-2：用0．3％BSA-Hanks液200~zL，稀釋細(xì)胞沉淀，然后小心加到預(yù)先裝有200／uL1mol／L蔗糖液（或85甲c硅油與15％石蠟油混合物）的Eppendoff塑料離心管中，10 000r／min離心2min，吸去上清及蔗糖層，丁計數(shù)儀測定cpm值。

    （4）計算：TB二總結(jié)合，為不加未標(biāo)記IL-2所測得的結(jié)合值；NB：非特異性結(jié)合，為加入100倍量未標(biāo)記IL-2后的結(jié)合值；SB二特異性結(jié)合，為TB與NB之差；特異性結(jié)合率（％）=[（TB—NB）/TB]×100％；非特異性結(jié)合率（％）=（NB）／（TB）X100％；F=游離¹²⁵I-IL-2濃度。

    然后再計算B／F，按受體結(jié)合理論的經(jīng)典方法Scatchard作圖，求出zui大結(jié)合容量（Bmax）和平衡常數(shù)（Kd值）。

    2．¹²⁵I抗IL-2RMcAb放射免疫分析  該法主要用于檢測IL-2Ra的數(shù)量，其操作步驟除用1251-抗IL-2RMeAb（或任何一株抗IL-2RaMoAb）替代¹²⁵I-IL-2外，與¹²⁵I-IL-2放射受體分析法*相同。受體與標(biāo)記抗體的結(jié)合受多種因素影響，如反應(yīng)環(huán)境的pH值、溫度、反應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量及孵育時間等。選用37~C、20min為標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間（pH7．4），細(xì)胞濃度為每反應(yīng)管0．5x10⁵—1x10⁵／200ul。經(jīng)與人外周血淋巴細(xì)胞孵育后繪制¹²⁵I抗IL-2RMcAb與細(xì)胞膜表面結(jié)合的飽和分析曲線。

    3．免疫熒光法檢測IL-2Ra⁺細(xì)胞比例

    為測定某一細(xì)胞群體中IL-2Ra⁺細(xì)胞的比例多采用免疫熒光技術(shù)，借助流式細(xì)胞儀（例如FACS）或熒光顯微鏡即可分辨出IL-2Ra⁺或IL-2Ra^-細(xì)胞。

    （1）抗體的選擇：*抗體可用任意一株抗IL-2RaMoAb，例如測定人源細(xì)胞時多選用抗Tac（Tac即為IL-2Ra鏈），第二抗體可選用FITC標(biāo)記的羊（或兔）抗鼠IgG。

（2）免疫熒光法測定：將5X105—10X105待測細(xì)胞（如PHA刺激的人T淋巴細(xì)胞）與人Ig共孵育15min以去除抗體Pc段的非特異性結(jié)合（此步可省略），然后將細(xì)胞懸浮于100t~LPBS中，加入如S／1001~L抗Tac抗體，4~C孵育30-60rain。細(xì)胞用冷PBS洗滌2～3次，加入適量稀釋的羊或兔抗鼠IsC-FITC結(jié)合物，4~C孵育30rain，細(xì)胞洗滌后可直接進(jìn)行FACS測定，或用0．7％的多聚甲醛固定，滴片后熒光顯微鏡下觀察。

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