酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。酶标记物中zui常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。目前，高质量的酶(如辣根过氧化物酶，简称HRP)国内已有商品供应。高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。

HRP标记抗体的方法--简易过碘酸钠法

1.　原理：经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的α-和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO４氧化HRP，从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO４氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH４(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。

2.　标记步骤:

　　(1)　称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。

　　(2)　于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO４溶液，室温下避光搅拌20分钟。

　　(3)　将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。

　　(4)　加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg IgG(抗体，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。

　　(5)　加0.1ml新配的4mg／ml NaBH４液，混匀，再置4℃2小时。

　　(6)　将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4℃过夜。

　　其余步骤(纯化)同戊二醛标记步骤的(6)、(7)、(8)。

3.　结果判定：

　　除标记物IgG量的计算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。

　　IgG量(mg／ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62

4.　试剂及器材:

　　(1)　0.1M NaIO４：称取241mg高碘酸钠(广州化学试剂厂，批号830602)溶于蒸馏水10ml中。

　　(2)　1mM PH4.4醋酸钠缓冲液:

　　0.2M NaAc (1.361克／50ml) 3.7ml

　　0.2M HAc (0.601ml／50ml) 6.3ml

　　加蒸馏水至2,000ml。

　　(3)　0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液:

　　　　　　　Na２CO３ 0.32克

　　　　　　　NaHCO３ 0.586克

　　　　　　　加蒸馏水至50ml

　　再用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液。

　　(4)　NaBH４溶液(4mg／ml):

　　临用时称取NaBH４4mg溶于1ml蒸馏水中。