抗肿瘤免疫治疗通过激活或增强患者的免疫系统来精确地攻击肿瘤细胞，是一种革命性的肿瘤内源性治疗理念。然而，乳腺癌等免疫抑制实体瘤对于免疫治疗仍然表现出较差的临床反应。这种免疫抑制生态位可以通过多种途径扭转，T细胞就在这一过程中起着核心作用。T细胞的持续激活依赖于cGAS-STING通路，该通路不仅在先天免疫中很重要，而且是适应性免疫反应的关键调节器。传统的外源性STING激动剂在临床应用中存在明显的局限性：一方面，带负电荷的分子结构阻碍了有效穿透细胞膜，导致细胞内递送效率不理想。另一方面，核酸酶的快速降解结合网状内皮系统介导的非特异性清除机制，显著降低了治疗药物的体内半衰期。研究表明，核膜完整性的破坏或线粒体功能障碍都将致使dsDNA的泄漏，这是触发先天免疫的关键内源性信号。这些内源性dsDNA分子与cGAS蛋白的正电荷结构域静电相互作用，诱导cGAS的构象变化。这导致一系列生化反应和信号级联反应，最终驱动I型干扰素的表达。因此，通过激活dsDNA的释放并结合免疫治疗成为一种值得探索的策略。

近日，安徽医科大学钱海生教授团队在国际期刊《ACS Nano》发表题为“Gelatin Methacryloyl Xerogel Puncture Implants Loaded with Cu0.5Mn2.5O4 Nanoparticles Synergizes Cuproptosis and STING Activation for Enhanced Breast Cancer Immunotherapy”的原创性论著。该研究通过可降解的肿瘤植入剂递送纳米颗粒实现了乳腺癌的免疫治疗，同时为实体瘤的穿刺植入递送药物提供了一种实用策略。

首先，研究人员通过水热法合成CMO纳米颗粒，然后冷冻干燥备用。随后制备植入剂，肿瘤植入剂的制备方法如图1a所示，首先加热与CMO纳米颗粒和富马酸单甲基（MMF）混合的GelMA水凝胶，然后将其添加到由摩方精密面投影立体光刻（PμSL）3D打印技术（nanoArch® S130，精度：2 μm）制备的模具中。水凝胶随后进行光交联和冷冻干燥，得到CMF植入剂。CMO纳米颗粒的透射电子显微镜（TEM）图像显示为均匀的空心球形结构（图1b），粒径约为300 nm。X射线衍射（XRD）结果表明，所制备的CMO纳米颗粒的特征峰与标准卡（Cu0.5Mn2.5O4, JCPDs 7-4367）的特征峰排列良好（图1d）。手机图像和扫描电镜（SEM）图像显示，制备的植入剂具有一致的圆柱形，可以插入穿刺活检针（图1f-h）。如图1j所示，将植入剂装入针管，然后用柱塞将植入剂推入肿瘤。将与罗丹明B结合的植入剂植入小鼠肿瘤，并通过体内成像观察植入剂的降解情况。结果表明，植入剂在体内至少保持了15天的缓慢降解，这对药物的持续作用非常有利（图1o）。

图1.CMO纳米颗粒和CMF植入剂的制备与表征。

随后，通过透射电镜观察4T1细胞对CMO纳米颗粒的摄取情况。CMO纳米颗粒被内化到细胞质中，靠近线粒体（图2a）。CCK-8检测评估植入剂和材料对细胞活力的影响。结果显示，含CMO纳米颗粒的种植体对4T1细胞活力的影响最为显著，使4T1细胞活力仅为对照组的20%。此外，CMO纳米颗粒和MMF对4T1细胞的活力都表现出明显的浓度依赖性（图2b）。细胞周期分析显示，在CMF植入剂处理的4T1细胞中，G1期细胞数量增加，G2/M期细胞数量明显减少（图2c，d）。细胞凋亡流式细胞术分析结果显示，CMO 植入剂和CMF 植入剂处理可显著提高4T1细胞的早期和晚期凋亡率，达到14.81%（图2e，f）。然而，这一比例仍明显低于CCK-8实验中观察到的80%的抑制率，这表明CMO植入剂或CMF植入剂处理的4T1细胞可能会经历其他形式的细胞死亡。

为了检测细胞内铜离子浓度，将4T1细胞与不同浓度的CMO纳米颗粒共孵育4小时后，再与罗丹明B酰肼（RBH）探针孵育30分钟，结果发现RBH的红色荧光强度与CMO纳米颗粒浓度呈正相关（图2g）。这些发现表明，CMO纳米颗粒在进入细胞后释放铜离子，这是诱导铜死亡的必要条件。铜离子可以引起线粒体损伤并改变线粒体膜电位，这可以用JC-1探针检测。图2i的结果显示，CMO植入剂和CMF植入剂处理4T1细胞后，JC-1绿色荧光信号明显增加，表明线粒体膜电位降低。CMO纳米颗粒表现出优异的GSH耗竭能力，GSH探针的荧光强度进一步证实了这一点（图2j）。随后评估CMF植入剂处理4T1细胞的耗氧率（OCR）。结果显示，CMF植入剂处理的4T1细胞的基础呼吸速率没有显著降低，而最大呼吸速率明显降低（图2k）。这一发现与铜死亡的特征一致。此外，与对照组相比，CMF植入剂处理后的4T1细胞线粒体明显收缩，膜密度增加，线粒体嵴减少甚至消失，线粒体损伤严重（图2l）。铜离子与乙?；腡CA循环蛋白结合导致DLAT寡聚化，通过Western blot分析验证了这一点（图2m）。

图2. CMF植入剂诱导4T1细胞的凋亡和铜死亡。

为了阐明CMF植入剂影响4T1细胞的机制，研究人员对对照组和CMF植入剂组进行了RNA转录组测序（RNA-seq）分析。Venn图显示，14029个基因在两个细胞组中共表达，而1469个基因在CMF植入剂组中表达（图3a）。两组差异表达基因（DEGs）的火山图显示，351个基因上调，而364个基因下调（图3b）。图3c中的基因热图显示了几个显著的基因变化，如与铜增生相关基因（Lias、Dld、Mt1/2、Slc30a1、Pdhb和Bcl2）和与cGAS-STING通路相关的基因（Cgas、Tbk1）的变化?；蚣患治觯℅SEA）显示，在CMF植入剂处理的4T1细胞中，糖酵解明显受到抑制，这可能是因为铜死亡触发了代谢重编程（图3d）。此外，内质网蛋白加工显著增加，这可能与激活cGAS-STING通路诱导细胞因子产生密切相关（图3e）。根据KEGG和GO分析，在CMF植入剂处理的细胞中，内质网中的蛋白质加工、抗原加工和递呈、cGMP-PKG信号通路、谷胱甘肽代谢过程、铜离子的应激反应和T细胞介导的细胞毒性被激活（图3f，g）。综上所述，RNA-seq结果揭示了CMF 植入剂处理后铜死亡激活的4T1细胞基因和cGAS-STING通路的转录变化。

图2. CMF植入剂诱导4T1细胞的凋亡和铜死亡。

采用激光共聚焦双光子成像系统观察不同植体配方处理4T1细胞mtDNA的释放情况，如图4a所示。为了确定不同植入剂处理后4T1细胞释放到细胞质中的mtDNA的相对量，使用小鼠线粒体DNA染料荧光定量PCR试剂盒对释放到细胞质中的mtDNA进行定量分析。值得注意的是，MMF 植入剂和CMO 植入剂组4T1细胞细胞质中mtDNA含量约为对照组的5倍，而CMF 植入剂组细胞细胞质中mtDNA含量高达对照组的17倍（图4b）。这些结果表明MMF和CMO 纳米颗粒都能积极影响mtDNA的释放，并且它们的联合使用会产生更明显的效果。

CMO植入剂和CMF植入剂处理显著增加了4T1细胞释放的ATP，提高了细胞膜上CRT的表达，降低了细胞核中HMGB1的含量（图4c-f），具有诱导免疫原性死亡的能力。并且在CMO植入剂和CMF植入剂处理的4T1细胞中，IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达水平显著升高，有利于免疫细胞的募集（图4g-i）。而IFN-β mRNA表达水平升高表明cGAS-STING通路激活，这与mtDNA的释放密切相关（图4j）。此外，这些细胞因子，特别是TNF-α和IL-6，促进DC的成熟，这反过来有助于抗原呈递和激活T细胞产生抗肿瘤反应。在CMO植入剂和CMF植入剂组中，BMDCs中IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA水平显著升高（图4l）。流式细胞术也显示相应处理后BMDCs的成熟度显著提高（图4m）。

图4. CMF植入剂在体外诱导抗肿瘤免疫反应。

为了更详细地探讨CMF植入剂在乳腺癌中的作用机制，研究人员对CMF植入剂治疗小鼠进行了RNA-Seq分析。值得注意的是，CD274基因显著下调，而PDCD1基因显著上调，这突出了CMF 植入剂与αPD-1联合治疗乳腺癌的潜在协同作用（图5b）。

随后，研究人员建立乳腺癌原位小鼠模型，研究CMF植入剂联合αPD-1对肿瘤的抑制作用（图5e）。当小鼠肿瘤体积超过100 mm3时进行治疗。将小鼠随机分为7组。小动物影像学结果显示，治疗后CMF植入剂联合αPD-1组肿瘤荧光面积最小，表明治疗效果良好（图5d）。治疗后，CMF植入剂+αPD-1组平均肿瘤体积为294.7 mm3，为CMF植入剂组651.3 mm3的45.2%（图5g，h）。CMF植入剂+αPD-1组平均肿瘤重量为202.68 mg，为CMF 植入剂组443.32 mg的45.7%。此外，治疗50天后，CMF 植入剂和αPD-1组小鼠的存活率仍为100%，而CMF 植入剂组小鼠的存活率为62.5%（图5i）。这些发现表明CMF植入剂治疗增强了乳腺癌对免疫检查点阻断（ICB）治疗的敏感性。

图5. 体内探究CMF植入剂对乳腺癌的治疗效果。

Western blot分析显示，与cGAS-STING通路相关的下游蛋白（如phos-STING、phos-TBK1和phos-IRF3）的表达显著增加，表明CMF 植入剂可以通过促进mtDNA的释放来激活cGAS-STING通路（图6a）。酶联免疫分析（ELISA）对不同治疗组肿瘤组织中细胞因子的分析表明，CMF 植入剂治疗显著提高了肿瘤中免疫活化细胞因子（CXCL10、IFN-γ、TNF-α、IFN-β）的水平（图6b）。因此，这些结果表明CMF 植入剂可以通过mtDNA-cGAS-STING轴和ICD激活抗肿瘤免疫应答。在这个过程中，肿瘤内的免疫细胞起着至关重要的作用。流式结果显示，与对照组相比，CMF植入剂和αPD-1处理的小鼠肿瘤中CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞和B细胞的比例更高。此外，CD8+ T细胞和NK细胞分泌IFN-γ和TNF-α显著增加（图6c-f）。这些结果提示CMF植入剂和αPD-1可以将淋巴细胞募集到肿瘤部位，激活其抗肿瘤活性。在CMF植入剂和αPD-1处理的小鼠肿瘤中，Treg细胞和MDSCs的数量明显低于对照组（图6k，l）。这一变化与CMF植入剂和αPD-1等因子诱导的ICD和TME中IFN-γ的释放密切相关。这些发现提示CMF植入剂和αPD-1可以改变TME中免疫细胞的组成，将“冷”肿瘤转化为对免疫治疗更敏感的“热”肿瘤。

图6. CMF植入剂在体内诱导免疫效应的机制分析。

在原发肿瘤部位植入可产生较强的先天和适应性免疫反应，显著影响TME，具有良好的肿瘤抑制作用。在这些结果的基础上，进一步研究CMF 植入剂和αPD-1对转移性肿瘤的治疗作用。为模拟转移瘤，分别建立小鼠双侧肿瘤模型和肺转移瘤模型。双侧肿瘤模型的建立及治疗方案如图7a所示。双侧肿瘤对照组的肿瘤标记为未治疗的原发性（UP）、未治疗的远处（UD）；双侧肿瘤治疗组的肿瘤标记为原发性治疗（TP）和远处治疗（TD）。在治疗期间，治疗组在原发和远处肿瘤部位的肿瘤重量均明显减轻（图7c），图7d为具有代表性的肿瘤图片。在整个治疗期间，治疗组肿瘤生长速度明显受到抑制。值得注意的是，治疗组的一些小鼠远端肿瘤缓解（图7e，f）。治疗后，原发和远端肿瘤中CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞、DC细胞和B细胞的浸润均明显增加（图7g、j-m）。免疫抑制细胞（如Treg细胞和MDSCs）比例明显降低（图7i，o）。因此，CMF植入剂和αPD-1诱导的原发性TME改变明显影响了远端肿瘤。

图7. 分析CMF 植入剂和αPD-1对远处肿瘤的抑制作用。

小鼠乳腺癌肺转移模型的建立及处理如图8a所示。原位乳腺癌小鼠在治疗期间的肿瘤体积变化如图8c所示。对照组肿瘤发展迅速，20天左右平均肿瘤体积达到1288 mm3，而CMF植入剂+αPD-1治疗组肿瘤体积仅为288 mm3。治疗后的肺组织图像显示，对照组小鼠的肺组织呈暗红色，组织中散布着许多乳腺癌的肺结节。相比之下，治疗组小鼠肺组织呈粉红色，乳腺癌肺结节数量明显减少（图8d）。与对照组相比，治疗组肺组织中CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞和成熟DC细胞的比例均显著升高（图8g）。此外，CD8+ T细胞和NK细胞的抗肿瘤活性均显著增强（IFN-γ和TNF-α分泌增加）（图8h，i）。这些发现表明，原发性乳腺癌的治疗已经激活了一种抗肿瘤免疫反应，这种免疫反应延伸到肺组织，增强了肺部免疫淋巴细胞的抗肿瘤能力。

图8. CMF 植入剂和αPD-1对肺转移瘤的抑制作用分析。

总结：研究人员开发了一个实用的药物输送系统，扩大了穿刺针的效用。该系统可以在未来应用于深部肿瘤的放射性粒子植入和抗癌药物的精确、微创输送，特别是对于晚期、转移性或无法手术的癌症患者。此外，研究人员设计了一种基于正反馈机制的免疫激活策略，通过肿瘤细胞代谢重编程重塑肿瘤免疫微环境，克服免疫逃避，从而促进后续的免疫检查点抑制治疗。CMF植入剂代表了一种开创性的策略，它将工程学、材料科学和免疫学相结合，为实体瘤的治疗提供了一种高效、安全、协同的局部到全身免疫解决方案。