信帆生物：游离脂肪酸（NEFA）检测试剂盒的正确使用方法

一、测定原理：

游离脂肪酸（NEFA）能与铜离子结合形成脂肪酸的铜盐而溶于氯仿中，其含量与游离脂肪酸含量成正比。用铜试剂测定其中铜离子的含量，即可推算出游离脂肪酸的含量。

二、试剂组成与配制（50管/48样）：

试剂一：氯--仿（分析纯），自备。

试剂二：缓冲液，40mL×1瓶，室温保存6个月。

试剂三：铜试剂，甲液30mL×1瓶，乙液 30mL×1瓶，丙液 5mL×1瓶，4℃保存6个月。试剂三铜试剂的配制：按甲液∶乙液∶丙液=10∶9∶1的比例进行配制，需多少配多少，配好后4℃可保存二周。

试剂四：显色剂，粉剂×2支，稀释液10mL×2瓶，4℃保存3个月。试剂四显色剂的配制：临用时将1支粉剂溶解于1瓶10mL稀释液中，配好后4℃可保存二周。

试剂五：棕榈酸标准品粉剂×2支，溶剂50mL×1瓶，4℃保存3个月。1000µmol/L棕榈酸标准品的配制：将一支粉剂用溶剂溶解后定容至20mL（注意用溶剂将装粉剂的小离心管洗净）。

试剂六：双蒸水40mL×1瓶（做空白管用）。

三、操作步骤：

1、分别取玻璃试管进行编号（最好用带盖的磨口试管进行实验，防止试剂挥发及更好的抽提）。

2、操作表：

[注]：详细操作步骤：

1、充分混匀准确抽提2分钟（用秒表计时）。如果您没有磨口试管，可用普通玻璃试管代替，但必须用保鲜薄膜封口，以便防止液体挥发及溅出。

2、抽提完后以3500转/分离心10分钟，若发现下层液体呈半凝固状态、凝固层较厚或下层液体不足2mL时，则可用小玻棒或移液器吸嘴轻轻搅拌后再次离心，直至分层清楚。

3、 然后用注射器接上硬膜外麻醉针套吸取上层液体及凝固层并弃之。

4、另取一个注射器及硬膜外麻醉针心针套，将硬膜外麻醉针心插入针套中，小心插入下层抽提液中，拔出针心，接上注射器，吸取下层抽提液2.3～2.5mL至另一试管中。（这样可避免上层液体及凝固层混入下层液体中，若混入上层液体及凝固层，则需重新离心后再取下层抽提液，否则会影响结果。）若偶然发现抽提液有雾状混浊，可放入37℃水浴1～2分钟即可。

5、再从上述试管中准确吸取2mL下层抽提液加入另一试管中，加显色剂进行显色。

6、比色皿在用双蒸水冲洗干净后，还必须用无水乙醇冲洗，然后加三氯--甲-调零，否则加入的三氯--甲-中会混有水珠（三氯--和水不互溶）。

7、操作工程中最好用玻璃管，某些材质的塑料离心管也可使用（用加入三氯---烷的方法验证是否可用）。

以上七点为实验成败的关键。硬膜外麻醉针本所有售。

四、计算公式及举例：

1、血清计算公式及举例：

①、公式：见说明书

②、计算举例：

取某人血清0.2mL按操作表进行游离脂肪酸测定。测得各管吸光度如下：空白管为0.045，标准管为0.311，测定管为0.159。则计算如下：

   2、组织样本计算公式及举例：

①、公式：见说明书

Cpr：组织样本蛋白浓度，gprot/L（prot指蛋白）。

注：非蛋白样可以将样本质量浓度替换蛋白浓度代入计算。

②、计算举例：见说明书

取大鼠10%肝组织匀浆上清液0.2mL按操作表进行游离脂肪酸测定。测得各管吸光度如下：空白管为0.045，标准管为0.311，测定管为0.293。10%肝组织中蛋白浓度为12.24g/L，则计算结果如下：

五、注意点：

1、实验必须用分光光度计比色，不可用酶标仪、半自动及全自动生化分析仪比色（有机溶剂对这些仪器会有损坏）。

2、显色前吸取下层抽提液时，吸管不要触及管壁，以免沾染管壁上粘着的铜试剂。下层抽提液必须清澈，否则会使结果偏高。

3、胆红素可被试剂一抽提而干扰比色，故黄疸血清须做一对照管，即最后不加显色剂而用正丁醇代替，在测定管光密度读数中减去此对照管的光密度读数。