永生化小鼠颅缝细胞 (iMSu) 是一种具有重要研究价值的细胞系，以下是其详细的操作使用指南：

培养条件

• 培养基配置 ：一般采用 DMEM/F12 培养基，添加 10% 胎牛血清（FBS）以及 1% 青霉素 - 链霉素溶液。

• 培养容器 ：建议使用经特殊处理的培养容器，如 PriCoat™ T25 培养瓶或 Applied Cell 细胞外基质涂层培养瓶。

• 培养环境 ：将培养瓶置于 37℃、5% CO? 的培养箱中进行培养，湿度保持在 70%-80%。

冻存与复苏

• 冻存操作 ：使用含 10% DMSO 的培养基或专门的冻存液作为冻存介质。将细胞悬浮液分装于冻存管中，每管 1×10? 个细胞左右。冻存时，可采用程序降温法，先置于 4℃ 30 分钟，再转移至 - 20℃ 30 分钟，最后放入液氮中长期保存。也可使用冻存盒，将冻存管放入冻存盒中，放置 - 80℃冰箱过夜，之后转入液氮保存。

• 复苏流程 ：从液氮中取出冻存管，迅速放入 37℃水浴中快速解冻，同时轻轻摇动冻存管以加速解冻过程。解冻后的细胞悬液应立即转移至含有适量预温培养基的离心管中，轻轻吹打混匀后，以 125xg 的速度离心 5 分钟。弃去上清液，用新鲜的培养基重悬细胞沉淀，将细胞悬液接种到预先准备好的培养瓶中，加入适量的培养基，置于 37℃、5% CO? 的培养箱中培养。

传代操作

• 传代时机 ：当细胞在培养容器中的生长密度达到 80% 左右时，即可进行传代操作。一般来说，每周可进行 1 至 2 次传代，但具体的传代频率还需根据细胞的生长状态和实验需求进行调整。

• 传代步骤 ：首先吸除培养瓶中的旧培养基，加入适量的 PBS 润洗细胞，以去除残留的培养基和杂质。然后加入 0.25% 的胰蛋白酶 - EDTA 溶液，在显微镜下观察细胞，待细胞大部分脱落时，加入等体积的培养基终止胰蛋白酶的作用。将细胞悬液转移至离心管中，以 125xg 的速度离心 5 分钟，弃去上清液，用新鲜的培养基重悬细胞沉淀，按照 1:2 至 1:4 的比例将细胞悬液分装到新的培养瓶中，并加入适量的培养基，继续进行培养。

注意事项

• 无菌操作 ：在整个操作过程中，包括培养、冻存、复苏和传代等环节，都必须严格遵守无菌操作原则，以防止微生物的污染，确保细胞的健康生长。

• 细胞状态监测 ：定期观察细胞的形态和生长状态，记录细胞的生长曲线，及时发现并处理可能出现的问题，如细胞污染、生长异常等。

• 培养基更换 ：根据细胞的生长速度和实验需求，一般每 2 至 3 天更换一次培养基，以提供充足的营养物质，维持细胞的良好生长状态。