動物模型，是醫(yī)學(xué)研究者精心構(gòu)建的模擬人類疾病表現(xiàn)的生命載體，其精準(zhǔn)復(fù)刻了疾病的復(fù)雜進(jìn)程與關(guān)鍵特征。主要用于實驗生理學(xué)、實驗病理學(xué)和實驗治療學(xué)（包括新藥篩選）研究。比如一些經(jīng)典的動物模型———EAE模型、糖尿病模型、腸炎模型、帕金森模型、AD模型等。

實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是 MS 最常見的動物模型，具有許多臨床和病理生理學(xué)特征。EAE模型多種多樣，反映了人類 MS 的不同臨床、免疫學(xué)和組織學(xué)特征。通過主動誘導(dǎo)的 EAE 小鼠模型是最容易誘導(dǎo)且結(jié)果穩(wěn)健、可復(fù)制的模型。它特別適合使用轉(zhuǎn)基因小鼠研究藥物或特定基因?qū)ψ陨砻庖咝陨窠?jīng)炎癥的影響。因此，小鼠通過皮下注射中樞神經(jīng)系統(tǒng)勻漿或髓鞘蛋白肽進(jìn)行免疫。

由于這些肽的免疫原性較低，因此使用了強(qiáng)效佐劑。EAE 的易感性和表型取決于所選抗原和嚙齒動物品系。C57BL/6 小鼠是轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建中較常用的品系，且對髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白（MOG）有反應(yīng)。將免疫原性表位 MOG35-55 懸浮在wan全弗氏佐劑（CFA）中進(jìn)行免疫，并在免疫當(dāng)天及兩天后注射百日咳毒素。小鼠在免疫后 9-14 天內(nèi)出現(xiàn)“經(jīng)典”自限性單相 EAE，表現(xiàn)為上升性弛緩性癱瘓。小鼠每天使用臨床評分系統(tǒng)進(jìn)行評估，持續(xù) 25-50 天。

EAE模型誘導(dǎo)的成功率受多種因素的影響，包括小鼠的種類和性別、百日咳毒素的劑量、佐劑的使用、乳化程度以及豐富的實驗基礎(chǔ)和建模經(jīng)驗。今天小愛著重為大家講解EAE造模過程中需要注意的細(xì)節(jié)。

一、EAE造模方法

1、實驗動物：6-8周齡的雌性C57BL/6小鼠

2、動物適應(yīng)：將動物在實驗環(huán)境中適應(yīng)1周，保持溫度、濕度和光照條件穩(wěn)定，并使它們能夠自由獲取食物和水。

3、EAE模型建立

（1）MOG(35-55)溶液配制：將 MOG(35-55)（abs815889）多肽粉末充分溶解于預(yù)冷（4℃）無菌 PBS，終濃度為2.0 mg/mL。
注意：多肽溶解后常溫下易變性，長時間儲存容易失效，并且會有凍融穩(wěn)定性風(fēng)險，建議現(xiàn)配現(xiàn)用。

（2）CFA溶液配制：將熱滅活結(jié)核桿菌 H37 Ra 懸浮于CFA（abs9270）或弗氏不wan全佐劑（abs9271）中，并通過充分?jǐn)嚢?，熱滅活結(jié)核桿菌的終濃度達(dá)到 8.0 mg/mL。
警告：熱滅活的結(jié)核分枝桿菌刺激先天免疫反應(yīng)，避免吸入、攝入以及與皮膚和眼睛接觸。制備佐劑時嚴(yán)格避免針刺傷，因為它可能導(dǎo)致肉芽腫或誘發(fā)自身免疫反應(yīng)。

※熱滅活的結(jié)核分枝桿菌的作用及使用濃度

① 增強(qiáng)免疫原性

提供“危險信號”：結(jié)核桿菌的細(xì)胞壁成分（如分枝桿菌酸、脂阿拉伯甘露聚糖等）可通過Toll樣受體（TLR2/4）激活固有免疫系統(tǒng)，促進(jìn)抗原提呈細(xì)胞（APC）的成熟和炎癥因子（如IL-12、TNF-α）的釋放，從而增強(qiáng)對MOG35-55的免疫應(yīng)答。
誘導(dǎo)Th1/Th17極化：結(jié)核桿菌成分可驅(qū)動CD4+ T細(xì)胞向促炎的Th1（分泌IFN-γ）和Th17（分泌IL-17）亞群分化，這是EAE發(fā)病的核心機(jī)制。

② 形成肉芽腫反應(yīng)

結(jié)核桿菌的持續(xù)刺激可導(dǎo)致注射部位形成肉芽腫，延長抗原釋放時間，維持慢性炎癥狀態(tài)。

③ 終濃度范圍：4–10 mg/mL，過高濃度（>10mg/mL）可能導(dǎo)致過度炎癥或動物死亡。

④ 愛必信的CFA（abs9270）每毫升含 1mg 熱滅活的干燥結(jié)核分枝桿菌 (H37Ra, ATCC 25177)。

（3）抗原乳液制備：按照 1:1 體積比將MOG(35-55)多肽溶液和 CFA 溶液加入兩支 10mL 玻璃注射器中，并通過三通連接兩支注射器。在冰上反復(fù)推注40min-2h，將抗原乳化至油包水狀態(tài)，MOG(35-55)多肽濃度達(dá)到 1.0mg/mL。

注意：①肽段的純度必須>98%；

②在制作乳液的過程中，損失量是很大的（一般損失1/3—1/2）。理論上一只小鼠需注射MOG肽200ug，十只鼠2mg，但加上損失量，免疫十只鼠需稱取4mg，以防損失后不夠用。乳液剩余，可放入4度冰箱，一星期之內(nèi)使用沒問題；

③乳液制備不能使用塑料注射器，避免有機(jī)溶劑干擾，防止蛋白質(zhì)吸附；

④乳劑可在免疫前儲存數(shù)天。制備乳劑后至少等待30分鐘以觀察其是否穩(wěn)定，溶液應(yīng)呈白色、粘稠且無相分離。免疫前，將溶液抽入兩個注射器中的一個，并連接針頭。

（4）PTX 溶液的制備：將50μg百日咳毒素（abs42024900）在500μL ddH2O（雙蒸水）中復(fù)溶，得到100 μg/mL的儲備液，儲存于4 °C。取 PTX儲備液加入無菌 PBS（abs962） 中稀釋，終濃度達(dá)到 3.0 ng/μL；
警告： 百日咳毒素具有多種生物學(xué)效應(yīng)。避免吸入、攝入以及與皮膚和眼睛接觸。

（5）麻醉小鼠：使用異氟烷麻醉小鼠；

（6）EAE 模型：首先對麻醉后小鼠剃毛，在背部皮下、腋窩和腹股溝各皮下注射 50.0 μL 由 CFA 乳化的MOG(35-55)多肽溶液（確保皮下形成一個球狀腫塊，該腫塊應(yīng)在整個實驗過程中持續(xù)存在）。在MOG(35-55)多肽乳液注射當(dāng)天和 48 h 后，通過腹腔注射300ng/只的 PTX以增強(qiáng)疾病誘導(dǎo)（在小鼠尾根部進(jìn)行顏色標(biāo)記，確?？梢暂p松識別個體小鼠以進(jìn)行每日評估）。

二、EAE模型監(jiān)測

（1）臨床評分及體重監(jiān)測

應(yīng)每日評估體重和臨床評分。EAE的發(fā)作通常與體重減輕相關(guān)，每日監(jiān)測并記錄 EAE 小鼠臨床表現(xiàn)及體重變化。

① 標(biāo)準(zhǔn)化評分系統(tǒng)0-5分量表（較常用）：從第0天開始，連續(xù)觀察30天或更長時間。 評分標(biāo)準(zhǔn)：0分：無癥狀。1分：尾部無力或癱瘓。2分：后肢無力。3分：后肢癱瘓。4分：四肢癱瘓。5分：死亡。

② 體重監(jiān)測：EAE小鼠通常伴隨體重下降（>10%提示模型成功），需每日記錄，體重持續(xù)下降可能需倫理干預(yù)。

注意：當(dāng)小鼠出現(xiàn) EAE 臨床癥狀時，重要的是確保水瓶仍然可以被觸及，并將食物放在籠子地板上。

圖1 具有EAE癥狀的免疫小鼠圖片

圖2 典型疾病進(jìn)程(n=6)

（2）行為學(xué)檢測

① 運動功能評估

轉(zhuǎn)棒實驗（Rotarod）：加速模式（4-40 rpm，5min內(nèi)完成）記錄跌落時間，反映協(xié)調(diào)性與耐力。

步態(tài)分析（CatWalk或足印法）：量化步幅長度、基寬、擺動速度。

② 抑郁樣行為檢測

強(qiáng)迫游泳實驗（FST）：記錄不動時間（反映絕望行為）。

懸尾實驗（TST）：輔助驗證抑郁表型。

（3）組織病理學(xué)驗證

① 取材與處理

灌注固定：4%多聚甲醛灌注后取脊髓（腰膨大段）和腦組織。

切片制備：石蠟切片（5μm）或冷凍切片（10μm）。

② 染色方法

（4）分子生物學(xué)驗證

① 流式細(xì)胞術(shù)

細(xì)胞亞群分析：Th1（CD4+IFN-γ+）、Th17（CD4+IL-17+）、Treg（CD4+FoxP3+）。

樣本來源：脾臟、淋巴結(jié)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)單細(xì)胞懸液。

② 細(xì)胞因子檢測

ELISA/液相芯片：促炎因子：TNF-α、IL-6、IL-17

抗炎因子：IL-10、TGF-β

qPCR：脊髓/腦組織中細(xì)胞因子mRNA表達(dá)。

③ 蛋白表達(dá)分析

Western Blot：

炎癥通路蛋白：NF-κB p65、pSTAT3

神經(jīng)保護(hù)標(biāo)志物：BDNF、NGF

三、模型成功標(biāo)準(zhǔn)

基礎(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)：發(fā)病率>80%（臨床評分≥2）；病理確認(rèn)HE顯示炎性浸潤+ LFB證實髓鞘脫失。

高級標(biāo)準(zhǔn)：行為學(xué)異常（Rotarod時間↓50%）；分子標(biāo)志物：Th17比例↑2倍，CNS中IL-17水平顯著升高。

四、EAE造模無癥狀原因分析

五、EAE動物模型特色應(yīng)用案例

1. PTX構(gòu)建C57BL/6小鼠EAE模型，成功揭示了SPAK信號通過調(diào)控脈絡(luò)叢屏障驅(qū)動MS病理的核心作用，并為SPAK-NKCC1抑制劑（如ZT-1a、布美他尼）治療MS提供了臨床前證據(jù)。

引用文獻(xiàn)：J Neuroinflammation. 2025 Mar 13;22:80. IF:9.3

2. PTX構(gòu)建SD大鼠EAE 模型，研究Roflumilast在調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥，改善多發(fā)性硬化癥(MS)運動功能和抑郁癥狀中的作用。

引用文獻(xiàn)：J Affect Disord. 2024 Apr 1:350:761-773. IF:6.6

參考文獻(xiàn):

[1] Qi C, Wang Y, Li X, et al. Target inhibition of SPAK in choroid plexus attenuates T cell infiltration and demyelination in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroinflammation. 2025;22(1):80.

[2] Wang Z, Zhang Y, Chai J, et al. Roflumilast: Modulating neuroinflammation and improving motor function and depressive symptoms in multiple sclerosis. J Affect Disord. 2024;350:761-773.

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