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內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色試劑盒的使用細(xì)節(jié)需根據(jù)具體試劑類型和實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行調(diào)整，以下結(jié)合不同試劑盒的特點(diǎn)及操作要點(diǎn)進(jìn)行詳細(xì)說明：
一、試劑準(zhǔn)備與工作液配制
1. 染料特性與分裝：
- 常用探針如E01(藍(lán)色熒光，Ex/Em=373/430nm)、ER Green(綠色熒光，Ex/Em=490/520nm)或ER示蹤劑&8482;紅(紅色熒光，Ex/Em=589/620nm)，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇。
- 染料母液通常為DMSO溶液，需避免反復(fù)凍融。建議使用時(shí)分裝為小管，每管一次性使用，長期保存需-20℃避光。
2. 工作液稀釋：
- 初始稀釋：用染料稀釋液將母液稀釋10倍，再用HBSS緩沖液或培養(yǎng)基進(jìn)一步稀釋50-500倍(貼壁細(xì)胞)或20-100倍(需固定/透化的樣本)。
- 濃度優(yōu)化：最終工作濃度需根據(jù)細(xì)胞類型預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，原則是“至低有效濃度”，避免背景干擾和細(xì)胞毒性。
二、細(xì)胞染色流程
1. 貼壁細(xì)胞染色：
- 預(yù)處理：棄去培養(yǎng)基，用HBSS緩沖液輕洗細(xì)胞1次，移除殘留血清或酚紅(可能干擾熒光)。
- 孵育：加入預(yù)熱的染色工作液(37℃)，覆蓋細(xì)胞即可。孵育時(shí)間15-40分鐘，需避光操作。
- 清洗：吸除染液，用新鮮培養(yǎng)基或HBSS洗滌3次，去除游離探針。
2. 懸浮細(xì)胞染色：
- 重懸染色：離心棄上清，用預(yù)熱的染色工作液重懸細(xì)胞，37℃孵育15-40分鐘[。
- 貼壁輔助：可選多聚賴氨酸處理蓋玻片，使細(xì)胞貼附后染色，后續(xù)操作同貼壁細(xì)胞。
三、固定與透化(可選)
1. 固定：
- 用含2-4%甲醛的HBSS或培養(yǎng)基固定細(xì)胞10分鐘，室溫或37℃均可。固定后熒光信號可能部分衰減，需優(yōu)化固定條件。
2. 透化：
- 去污劑法：0.2% Triton X-100的PBS孵育10分鐘，適用于免疫染色(ICC)前處理。
- 丙酮法：預(yù)冷丙酮透化5分鐘，可降低背景信號，但可能破壞部分膜結(jié)構(gòu)。
四、觀察與數(shù)據(jù)采集
1. 濾光片選擇：
- 根據(jù)探針調(diào)整顯微鏡濾光片，如FITC通道(綠色)、德州紅通道(紅色)或自定義波段。
2. 活細(xì)胞與固定細(xì)胞差異：
- 活細(xì)胞染色需快速操作，避免長時(shí)間暴露導(dǎo)致探針泄漏；固定細(xì)胞可延長觀察時(shí)間，但需平衡固定造成的信號損失。
五、關(guān)鍵注意事項(xiàng)
1. 操作細(xì)節(jié)：
- DMSO母液冬季易凝固，需預(yù)熱至室溫并離心回收液體，吸頭需預(yù)熱防止染料吸附。
- 避光操作：探針對光敏感，染色及洗滌過程需盡量減少光照。
2. 兼容性與污染控制：
- 避免與其他品牌試劑混用，防止交叉污染。
- 使用一次性耗材，玻璃器皿需清洗并去除殘留清潔劑。
3. 實(shí)驗(yàn)優(yōu)化：
- 濃度與時(shí)間：不同細(xì)胞膜通透性差異大(如腫瘤細(xì)胞vs原代細(xì)胞)，需預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整染色條件。
- 多色染色：可搭配其他熒光標(biāo)記(如F-actin綠色、細(xì)胞核藍(lán)色)，但需驗(yàn)證探針光譜重疊性。
六、常見問題與解決方案
1. 背景過高：
- 降低探針濃度或縮短孵育時(shí)間。
- 增加洗滌次數(shù)或改用低吸附耗材。
2. 染色不均：
- 確保工作液覆蓋均勻，懸浮細(xì)胞需輕柔混勻。
- 貼壁細(xì)胞可延長孵育時(shí)間至30分鐘。
3. 熒光衰減：
- 固定后信號減弱屬正?，F(xiàn)象，可通過延長成像時(shí)間或提高激發(fā)強(qiáng)度補(bǔ)償。
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