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凍干中預(yù)凍的保存和低溫損傷

來源:優(yōu)醫(yī)全(天津)生物技術(shù)有限公司   2025年07月22日 08:47  

凍干(冷凍干燥)中的預(yù)凍保存和低溫損傷是兩個密切相關(guān)的核心問題,直接影響凍干產(chǎn)品的質(zhì)量和活性保留。以下從機制、問題及解決方案角度進行詳細解釋:

凍干中預(yù)凍的保存和低溫損傷

1. 預(yù)凍保存(Pre-freezing)

目的與機制

預(yù)凍是凍干的第一步,通過將樣品快速降溫至共晶點以下(通常-40℃以下),使樣品中的自由水凍結(jié)為冰晶,同時避免在后續(xù)升華階段因液態(tài)水殘留導(dǎo)致結(jié)構(gòu)塌陷。預(yù)凍的核心目標(biāo)是:

- 形成穩(wěn)定冰晶結(jié)構(gòu):為后續(xù)升華提供均勻的傳質(zhì)通道。

- 保護活性物質(zhì):通過玻璃化(vitrification)減少冰晶對生物大分子(如蛋白質(zhì)、細胞)的物理損傷。

- 抑制化學(xué)降解:低溫下降低酶活性及氧化反應(yīng)速率。


關(guān)鍵參數(shù)

- 降溫速率:

 - 快速冷卻(如液氮速凍):形成小冰晶,減少機械損傷,但可能導(dǎo)致細胞內(nèi)水未滲出,引發(fā)“胞內(nèi)冰晶損傷”。

 - 緩慢冷卻:允許水分逐漸遷移至細胞外凍結(jié),減少胞內(nèi)冰晶,但可能增加溶質(zhì)濃縮損傷。

- 終點溫度:需低于樣品的共晶點(通常-40~-50℃),確保固化。

- 保護劑(凍干賦形劑):如蔗糖、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等,可提高玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg'),穩(wěn)定生物分子結(jié)構(gòu)。


2. 低溫損傷(Cryoinjury)

低溫損傷是預(yù)凍過程中因冰晶形成、溶質(zhì)濃縮或相變導(dǎo)致的樣品活性損失,主要機制包括:

(1)冰晶機械損傷

- 細胞內(nèi)冰晶:快速冷卻時,胞內(nèi)水未及時滲出,形成尖銳冰晶刺破細胞膜。

- 細胞外冰晶:緩慢冷卻時,胞外冰晶擠壓細胞,導(dǎo)致膜破裂。

(2)溶質(zhì)效應(yīng)(Solution Effect)

- 水分凍結(jié)后,未凍結(jié)的液相中溶質(zhì)(鹽、緩沖液等)濃度急劇升高,導(dǎo)致:

 - pH偏移:破壞蛋白質(zhì)等生物分子的穩(wěn)定性。

 - 滲透壓失衡:細胞脫水收縮(胞內(nèi)溶質(zhì)外流)或膨脹破裂(復(fù)水時)。

(3)冷休克(Cold Shock)

- 脂質(zhì)膜在低溫下發(fā)生相變(液態(tài)→凝膠態(tài)),膜流動性下降,通透性改變。

(4)玻璃態(tài)破裂

- 若預(yù)凍未達到玻璃化(部分區(qū)域存在液態(tài)水),在升溫或干燥過程中可能發(fā)生反玻璃化(devitrification),導(dǎo)致冰晶重結(jié)晶。


3. 解決方案與優(yōu)化策略

(1)預(yù)凍工藝優(yōu)化

- 控制降溫速率:

 - 對細胞(如紅細胞、干細胞):慢速冷卻(0.1~1℃/min)結(jié)合保護劑,減少胞內(nèi)冰晶。

 - 對蛋白質(zhì)、疫苗:快速冷卻(如液氮噴淋)結(jié)合高濃度保護劑,實現(xiàn)玻璃化。

- 退火(Annealing):在預(yù)凍后短暫升溫至略低于共晶點,使小冰晶重排為大冰晶,減少升華阻力。

- 保護劑篩選:

 - 糖類(海藻糖、蔗糖):替代水分子與生物分子形成氫鍵,維持結(jié)構(gòu)。

 - 聚合物(PVP、BSA):抑制冰晶生長,提高Tg'。

(2)低溫損傷緩解

- 滲透保護:添加滲透性保護劑(如甘油、DMSO),平衡胞內(nèi)外滲透壓。

- 冰晶成核控制:添加冰核蛋白(如AFP)或納米顆粒,誘導(dǎo)均質(zhì)成核,減小冰晶尺寸。

- 避免溶質(zhì)濃縮:優(yōu)化緩沖液濃度(如使用低鹽配方),或替換易結(jié)晶的緩沖鹽(如磷酸鹽→ Tris)。


4. 應(yīng)用實例

- 生物醫(yī)藥:疫苗凍干中,預(yù)凍需快速形成玻璃態(tài)以保護病毒衣殼蛋白;使用海藻糖作為保護劑可顯著提高穩(wěn)定性。

- 食品工業(yè):果蔬凍干時,預(yù)凍速率過慢會導(dǎo)致細胞壁塌陷,影響復(fù)水性;退火處理可改善冰晶結(jié)構(gòu)。


總結(jié)

預(yù)凍保存與低溫損傷的平衡是凍干工藝設(shè)計的核心挑戰(zhàn)。通過調(diào)控降溫速率、保護劑配方及退火工藝,可最大限度減少低溫損傷,確保凍干產(chǎn)品的高活性回收率。實際應(yīng)用中需根據(jù)樣品特性(細胞、蛋白質(zhì)、食品等)進行個性化優(yōu)化。


凍干中預(yù)凍的保存和低溫損傷



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