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運(yùn)行ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀需要注意些什么?

來源:孚約生物科技(上海)有限公司   2025年07月21日 15:57  

使用ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀時(shí),需注意以下關(guān)鍵事項(xiàng)以確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和設(shè)備的安全運(yùn)行:


一、abi7500 pcr實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

1、樣本與試劑

使用高質(zhì)量、無污染的DNA/RNA模板和試劑(如引物、探針、Master Mix)。

避免試劑反復(fù)凍融,分裝保存以減少降解風(fēng)險(xiǎn)。

對RNA樣本進(jìn)行DNase處理,并確保cDNA合成質(zhì)量。

2、耗材選擇

使用光學(xué)級八聯(lián)管或96孔板,確保與儀器適配(如ABI認(rèn)證耗材)。

檢查管蓋是否密封,避免蒸發(fā)污染或信號干擾。

3、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)置陰性對照(無模板對照,NTC)和陽性對照,監(jiān)測污染和擴(kuò)增效率。

合理設(shè)計(jì)復(fù)孔(建議至少3個(gè)技術(shù)重復(fù))以提高數(shù)據(jù)可靠性。


二、abi7500 pcr操作注意事項(xiàng)

1、校準(zhǔn)與維護(hù)

定期進(jìn)行 ROX校準(zhǔn)(針對染料校正)和 光學(xué)校準(zhǔn)(確保熒光信號穩(wěn)定性)。

清潔樣品槽和光學(xué)部件,避免灰塵或污染物干擾熒光檢測。

2、程序設(shè)置

確認(rèn)反應(yīng)程序(變性、退火、延伸溫度和時(shí)間)與引物/探針匹配。

設(shè)置正確的熒光通道(如FAM、VIC、ROX等),避免信號串?dāng)_。

3、加樣與上機(jī)

加樣時(shí)避免氣泡(可能影響熒光讀?。x心后再上機(jī)。

確保反應(yīng)板/管在樣品槽中放置平整,避免孔位偏移。


三、數(shù)據(jù)分析與質(zhì)控

1、基線閾值設(shè)置

手動調(diào)整基線(Baseline)和閾值(Threshold),確保Ct值準(zhǔn)確。

檢查擴(kuò)增曲線是否平滑,排除異??祝ㄈ缙鸱暹^早或非特異性擴(kuò)增)。

2、熔解曲線分析(若適用)

確認(rèn)單峰特異性,多峰可能提示引物二聚體或污染。

3、效率評估

標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率應(yīng)在 -3.1~-3.6 之間(對應(yīng)擴(kuò)增效率90%~110%)。


四、安全與維護(hù)

1、防污染措施

分區(qū)操作(試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)、擴(kuò)增區(qū)),使用帶濾芯槍頭。

定期用10%漂白劑或乙醇清潔工作臺。

2、儀器保養(yǎng)

關(guān)機(jī)前清潔樣品槽,定期聯(lián)系工程師進(jìn)行專業(yè)維護(hù)。

避免長時(shí)間連續(xù)運(yùn)行,防止過熱。


通過嚴(yán)格遵循上述步驟,可減少實(shí)驗(yàn)誤差,確保熒光定量PCR結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。如遇異常問題,建議參考儀器手冊或聯(lián)系A(chǔ)BI技術(shù)支持。

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