自新冠之后LNP 進(jìn)行RNA遞送，一直是一個(gè)非常熱門的研究方向。2025年2月初，天津大學(xué)王躍飛團(tuán)隊(duì)在 《Advance Materials》期刊上發(fā)表《Modular Design of Lipopeptide-Based Organ-Specific Targeting (POST) Lipid Nanoparticles for Highly Efficient RNA Delivery》。該文主要研究了基于脂肽（lipopeptide, LP）的模塊化設(shè)計(jì)，開(kāi)發(fā)了一種具有高效RNA遞送能力和器官特異性靶向能力的脂質(zhì)納米顆粒（lipid nanoparticles, LNPs），并命名為POST（Organ-Specific Targeting）LNPs。

1. 研究背景

RNA療法在治療癌癥、傳染病、遺傳性疾病等多種疾病中顯示出巨大潛力。脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）是目前最有前景的RNA遞送系統(tǒng)之一，其典型成分包括可電離脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)、膽固醇和PEG化脂質(zhì)。然而，LNPs在應(yīng)用中面臨的一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)是其在體內(nèi)的系統(tǒng)性肝積累，限制了其在肝外器官的靶向能力。近年來(lái)，研究者們通過(guò)篩選可電離脂質(zhì)結(jié)構(gòu)、添加主動(dòng)靶向配體以及調(diào)節(jié)輔助脂質(zhì)或膽固醇的性質(zhì)等方法，取得了一定進(jìn)展。例如，通過(guò)引入第五種選擇性器官靶向（SORT）輔助脂質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)脾臟、肺和骨髓的精準(zhǔn)mRNA遞送。

2. 研究目的

本研究旨在開(kāi)發(fā)一種高效的可電離脂質(zhì)，通過(guò)脂肽（LPs）的模塊化設(shè)計(jì)，構(gòu)建具有器官特異性靶向能力的LNPs。脂肽結(jié)合了肽的生物相容性、可設(shè)計(jì)性和靶向性，以及脂質(zhì)的疏水性，有望提升LNPs的RNA遞送效率和靶向性。

3. 研究方法

脂肽（LPs）的設(shè)計(jì)與合成

研究者設(shè)計(jì)并合成了一系列基于賴氨酸-組氨酸的脂肽（KH-LPs），其結(jié)構(gòu)包括一個(gè)極性頭（KHn，n為氨基酸數(shù)量，2-12）和一個(gè)非極性尾（Ax或Ex，A表示烷醇，E表示烯醇，x為碳原子數(shù)量，10-18）。通過(guò)簡(jiǎn)單的一步環(huán)開(kāi)反應(yīng)，合成了25種不同的KH-LPs，并將其與四種輔助脂質(zhì)（DOTAP、DOPE、DSPC和14PA）組合，構(gòu)建了包含100種四組分LP-LNPs的篩選庫(kù)。

篩選策略

研究者通過(guò)體外和體內(nèi)篩選，評(píng)估了這些KH-LP LNPs在遞送mRNA和siRNA方面的能力。體外篩選使用人肺癌細(xì)胞A549作為測(cè)試細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)mRNA表達(dá)效率和siRNA沉默效率。體內(nèi)篩選則通過(guò)在C57BL/6小鼠中注射封裝了熒光素酶mRNA的LNPs，觀察其在不同器官中的生物發(fā)光信號(hào)，以評(píng)估器官靶向性和遞送效率。

基于賴氨酸-組氨酸的脂肽庫(kù)（KH-LP）和基于四組分脂肽的器官特異性靶向（POST）LNP篩選庫(kù)的模塊化設(shè)計(jì)

4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

體外篩選結(jié)果

在95種細(xì)胞毒性較低（細(xì)胞存活率>80%）的KH-LP LNPs中，16種在A549細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了超過(guò)70%的mRNA表達(dá)效率，其中A10-KH2/DOTAP表現(xiàn)最佳，達(dá)到96.8%。

在siRNA遞送方面，29種KH-LP LNPs實(shí)現(xiàn)了低于20%的靶基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平，A10-KH2/DOTAP同樣表現(xiàn)最佳，沉默效率達(dá)到97.3%。

進(jìn)一步測(cè)試表明，A10-KH2/DOTAP在多種難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中均表現(xiàn)出優(yōu)異的mRNA和siRNA遞送能力，優(yōu)于商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑和經(jīng)典的SM-102 LNP。

結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系（SAR）分析

研究發(fā)現(xiàn)，高效的KH-LP LNPs通常具有以下特性：pKa值在6-7之間（有利于RNA遞送）、包封率（ee）>80%、粒徑<120 nm、多分散指數(shù)（PDI）<0.2，且在中性條件下zeta電位接近中性。

不同的輔助脂質(zhì)系統(tǒng)對(duì)KH-LPs的選擇性不同。例如，DOTAP（正電荷）更適合與短鏈KHn頭結(jié)合，而DOPE、DSPC和14PA（弱RNA結(jié)合能力）則更適合與長(zhǎng)鏈KHn頭結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)高效的RNA結(jié)合、細(xì)胞攝取和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)逃逸。

體內(nèi)篩選結(jié)果

在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，A10-KH2/DOTAP表現(xiàn)出肺部特異性靶向能力，其生物發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度高于經(jīng)典的肺部靶向LNP（如SORT MC3/DOTAP LNP）。

A10-KH4/DOPE和A18-KH4/DOPE分別在肝臟和脾臟中表現(xiàn)出高效遞送能力，且優(yōu)于或至少與經(jīng)典的肝臟靶向LNP和脾臟靶向LNP相當(dāng)。

通過(guò)冷凍透射電子顯微鏡（cryo-TEM）觀察，POST LNPs呈球形，具有多層外殼和非晶態(tài)核心。

siRNA遞送能力

在體內(nèi)siRNA遞送實(shí)驗(yàn)中，POST LNPs在靶向器官中表現(xiàn)出更高的特異性和沉默效率，優(yōu)于對(duì)應(yīng)的SORT LNPs

在劑量依賴性實(shí)驗(yàn)中，肺和肝臟POST LNPs在0.1 mg/kg劑量下仍能實(shí)現(xiàn)超過(guò)50%的沉默效率，而脾臟POST LNP在0.01 mg/kg劑量下即可達(dá)到超過(guò)50%的沉默效率

穩(wěn)定性和生物相容性

POST LNPs在4°C下儲(chǔ)存9天后，其mRNA遞送能力、粒徑、PDI和包封率均保持穩(wěn)定。

在重復(fù)給藥實(shí)驗(yàn)中，小鼠在連續(xù)三次給藥后，靶向器官中PTEN基因水平持續(xù)保持低水平，且小鼠體重呈上升趨勢(shì)，表明POST LNPs具有良好的生物相容性。

5. 結(jié)論

本研究通過(guò)模塊化設(shè)計(jì)的KH-LPs和輔助脂質(zhì)，成功開(kāi)發(fā)了一系列具有高效RNA遞送能力和器官特異性靶向能力的POST LNPs。這些LNPs在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出優(yōu)異的性能，具有簡(jiǎn)單組成、良好穩(wěn)定性和生物相容性，顯示出巨大的臨床應(yīng)用潛力。此外，SAR分析結(jié)果表明，通過(guò)精確調(diào)節(jié)LP的結(jié)構(gòu)和功能，可以為不同的靶向脂質(zhì)系統(tǒng)開(kāi)發(fā)出可電離成分，為未來(lái)的RNA療法提供了新的策略。

這項(xiàng)研究不僅為RNA遞送系統(tǒng)的設(shè)計(jì)提供了新的思路，還為開(kāi)發(fā)具有器官特異性靶向能力的納米藥物提供了重要的理論依據(jù)。通過(guò)模塊化設(shè)計(jì)和篩選策略，可以針對(duì)不同的疾病和靶器官開(kāi)發(fā)出個(gè)性化的RNA遞送系統(tǒng)，有望推動(dòng)RNA療法在臨床中的應(yīng)用。

S-RMab®單克隆抗體

文中使用斯達(dá)特?zé)晒鈽?biāo)簽偶聯(lián)抗體Goat anti-Rabbit IgG(H+L) (Alexa Fluor®?594 Conjugate) （貨號(hào)S0B4007）和Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488 Conjugate）（貨號(hào)S0B4017）進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)流程如下：

1.裝載mEGFP的POST LNP通過(guò)靜脈注射于C57BL/6小鼠（劑量為0.75mgkg?1）

2.48 h后，分離相應(yīng)的靶向組織（肝、脾、肺），制備冷凍切片（8 μm），用95%乙醇固定10 min

3.切片用PBS洗滌3次，用0.1% Triton X100滲透30 min，用5%正常山羊血清封閉1h

4.使用一抗在4°C下孵育過(guò)夜

5.清洗載玻片，使用斯達(dá)特二抗（1:500 dilution ）在室溫下孵育1小時(shí)

6.洗滌，用4′,6-diamidino-2-phenylindole孵育5 min，并封片

7.采用奧林巴斯IX73顯微鏡進(jìn)行成像

8.以1xPBS為陰性對(duì)照。