為解決這一問題，開發(fā)團(tuán)隊設(shè)計了多模態(tài)熒光成像平臺，將寬場熒光導(dǎo)航系統(tǒng)（WF-Nav）與微型化雙光子顯微成像和微型化三光子顯微成像進(jìn)行了整合。為充分發(fā)揮單光子激發(fā)的優(yōu)勢，WF-Nav系統(tǒng)配備了大視場和單細(xì)胞分辨率功能，可快速識別指定感興趣區(qū)域。一旦定位到目標(biāo)區(qū)域，系統(tǒng)可無縫切換至雙光子或三光子成像，進(jìn)一步實現(xiàn)高信噪比或深層神經(jīng)元成像。隨后將m2PM或m3PM探頭固定于小鼠頭部，釋放小鼠進(jìn)行自由活動成像。

圖1.多模態(tài)熒光成像系統(tǒng)設(shè)計

WF-Nav系統(tǒng)由一臺多色大視場寬場顯微鏡和多功能適配器組成。該系統(tǒng)采用三個LED作為激發(fā)光源（405nm，473nm，561nm），并配備高數(shù)值孔徑的非球面聚光透鏡對LED光束進(jìn)行準(zhǔn)直，每個激發(fā)光路均配有相應(yīng)的濾光片組。為實現(xiàn)大視場導(dǎo)航并為無縫切換多光子鏡組提供充足空間，開發(fā)團(tuán)隊設(shè)計了一款長工作距離、低倍率的干式物鏡。該物鏡（3.3x）采用反遠(yuǎn)攝設(shè)計：前組為兩片膠合雙合透鏡提供負(fù)光焦度，后組由單片球面透鏡構(gòu)成。這種結(jié)構(gòu)將主平面后移以校正色差，在保持?jǐn)?shù)值孔徑的同時實現(xiàn)了超長有效焦距的工作距離，最終達(dá)成90mm工作距離的突破性指標(biāo)，并實現(xiàn)了Φ5.64mm的最大成像視場。

圖2.寬場熒光顯微鏡設(shè)計

為實現(xiàn)寬場模式與多光子成像模式間的無縫切換，該團(tuán)隊設(shè)計了一款多功能適配器。該適配器連接寬場物鏡，并在Z軸電動平臺上進(jìn)行焦距調(diào)節(jié)。通過標(biāo)準(zhǔn)化的m2/3PM探頭設(shè)計，探頭可穩(wěn)固的安裝在同一支架上，并保證了多光子與寬場模式切換時的齊焦成像。

圖3.多功能適配器與齊焦功能

此款90mm工作距離的物鏡為操作頭件、光纖或加裝可拆卸電動變焦透鏡模塊提供了充足空間。頭件支架安裝在滑動阻力極?。s0.1N）、伸縮距離12 mm的輕型直線滾珠滑軌上，可有效避免物鏡與樣本的碰撞風(fēng)險。通過更換頭件支架，系統(tǒng)可兼容不同頭件，如mini2P和m3PM。此外，得益于微型化化雙光子顯微鏡的尺寸與可回縮設(shè)計，相較于常規(guī)臺式物鏡，該系統(tǒng)在大多數(shù)方向上提供了更大的觀察角度，從而帶來了更廣的樣本觀察范圍。這一設(shè)計顯著提升了樣本的粗定位效率。

圖4.不同物鏡與微型化雙光子顯微鏡觀察角的對比

接下來，開發(fā)人員評估了寬場熒光顯微鏡的光學(xué)性能與實際應(yīng)用。對Thy1-YFPH小鼠的腦切片進(jìn)行成像，可以清晰識別出神經(jīng)元和軸突。在470nm波長下進(jìn)行活體鈣離子成像，561nm波長下進(jìn)行形態(tài)學(xué)成像，成功捕獲了3804個GCaMP6f標(biāo)記的神經(jīng)元以及4650個表達(dá)mCherry的小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞。這些結(jié)果證明了該寬場顯微鏡具備多色、單細(xì)胞分辨率和高通量成像能力，并提供了對感興趣目標(biāo)區(qū)域?qū)Ш降某錾阅堋?/p>

視頻5.微型化寬場顯微鏡高通量成像

為了讓自由活動小鼠中的m2PM成像工作更加順暢，開發(fā)人員建立了一套標(biāo)準(zhǔn)化成像流程，以提高自由活動動物中m2PM成像的效率。首先對動物進(jìn)行病毒注射和外科手術(shù)操作，如顱窗植入或GRIN Lens植入，隨后等待2-4周確保病毒充分表達(dá)及手術(shù)損傷恢復(fù)。以某次實驗為例，我們在初級運動皮層（M1）神經(jīng)元中標(biāo)記了GCaMP6s和mCherry，隨后將小鼠固定于WF-Nav裝置下的跑步機(jī)上。接著通過寬場顯微鏡定位目標(biāo)感興趣區(qū)域并將其對準(zhǔn)視野中心。隨后通過適配器切換至m2PM模式，在920nm和1030nm波長下進(jìn)行雙色雙光子成像，最后對XY軸和焦平面進(jìn)行精細(xì)調(diào)整，可以在幾分鐘內(nèi)確認(rèn)最終的目標(biāo)區(qū)域。大多數(shù)情況下，會將目標(biāo)焦平面抬高約25µm，以補(bǔ)償水泥收縮導(dǎo)致的焦點偏移，再將Baseplate固定在動物頭部的頭件上，經(jīng)過約10分鐘的固化后，小鼠即可進(jìn)行自由活動成像。

圖6.標(biāo)準(zhǔn)化自由活動微型雙光子顯微成像流程

開發(fā)人員通過小鼠社交實驗中對神經(jīng)元的鈣信號和結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像，驗證了該系統(tǒng)，整個安裝操作過程耗時約20分鐘，成功率高達(dá)100%（n=15），即使是沒有經(jīng)驗的研究人員也能輕松掌握，從而極大提高了實驗效率。此外，對M1區(qū)第2層神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了多天重復(fù)成像，結(jié)果顯示在不重新安裝Baseplate的情況下，視野配準(zhǔn)穩(wěn)定。

圖7.多天相同視野成像

得益于標(biāo)準(zhǔn)化的機(jī)械設(shè)計，m3PM成像頭能夠便捷地安裝在支架上。應(yīng)用多功能適配器，可實現(xiàn)從寬場模式到三光子成像模式的無縫切換。由于寬場單光子顯微鏡成像深度存在局限，深層信號往往難以探測；雖然淺表血管可作為一定參考，但保留表層的病毒注射區(qū)域能提供更直接的熒光標(biāo)記，有助于在垂直軸上對準(zhǔn)更深部位。開發(fā)人員在頭部固定、表達(dá)GCaMP6f的小鼠中，成功從皮層表面記錄到深達(dá)1020μm的postsubiculum區(qū)神經(jīng)活動，并進(jìn)行小鼠曠場行為探索實驗，在670μm深度處記錄長時間鈣信號活動。

圖8.微型化三光子固定與自由行為成像

該工作由北京信息科技大學(xué)吳潤龍教授（通訊作者）、北京大學(xué)王愛民、程和平教授等人完成。

【參考文獻(xiàn)】

Wu R, Sun Y, Hao Z, et al. Wide-field fluorescence navigation system for efficient miniature multiphoton imaging in freely behaving animals. Neurophotonics. 2025;12(2):025018. doi:10.1117/1.NPh.12.2.025018