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载玻片是生物学、医学及材料科学实验中常用的工具之一，其使用规范直接影响样本制备质量、观察效果及实验结果的准确性。以下从载玻片的选择、清洁、样本处理、封片技术、染色与固定、标记与保存等环节，系统阐述其使用细节及注意事项。
一、载玻片的选择与预处理
1. 材质与类型
- 普通载玻片：用于常规组织、细胞或微生物观察，厚度通常为1-1.2mm，需满足透光性要求。
- 磨砂边载玻片：边缘磨砂处理，便于书写标记，避免滑脱。
- 带凹槽载玻片：用于液体样本(如血液、细菌悬液)，可防止样本流动。
- 荧光专用载玻片：低荧光背景，适用于荧光显微观察。
2. 清洁与灭菌
- 新载玻片处理：出厂时可能残留油脂或灰尘，需用70%乙醇擦拭，再以超纯水冲洗，烘箱干燥(60℃, 30分钟)。
- 重复使用载玻片：先用洗衣粉水煮沸去除蛋白残留，清水冲洗后浸泡于铬酸洗液(需戴防护手套)过夜，取出后流水冲洗12小时，烘干备用。
- 灭菌处理：高温高压灭菌(121℃, 20分钟)或紫外线照射30分钟，避免微生物污染。
二、样本加载与固定
1. 样本类型与加载方式
- 液体样本(如血液、细菌悬液)：
- 滴加少量样本(直径约5mm)于载玻片中央，避免过量导致溢出。
- 血液样本需推片制备血涂片：取一滴血置于一端，以另一载玻片边缘快速推平，形成均匀薄层。
- 固体样本(如组织切片、菌落)：
- 用镊子夹取样本，轻放于载玻片中央，最小化机械损伤。
- 培养细胞：
- 弃去培养基，用PBS轻洗后，胰酶消化收集细胞，滴加悬浮液并自然沉降。
2. 固定方法
- 空气干燥法：适用于血液、粪便样本，室温静置至干燥。
- 化学固定法：常用甲醇、乙醇或丙酮固定5-10分钟，用于细胞形态固定。
- 加热固定法：火焰灼烧载玻片背面(需远离样本)，快速通过以固定细菌涂片。
三、封片技术与盖玻片使用
1. 封片剂选择
- 水溶性封片剂：甘油、PBS(用于活细胞观察)。
- 非水溶性封片剂：中性树胶(如DPX)、指甲油(用于封片)。
- 荧光封片剂：抗荧光淬灭剂(如ProLong Gold)。
2. 盖玻片操作规范
- 倾斜接触法：以45°角缓慢放下盖玻片，避免产生气泡。
- 封片剂用量：液体样本需覆盖样本且不超过盖玻片1/3面积；过量会导致溢出或样本漂移。
- 排除气泡：轻压盖玻片边缘，用滤纸吸除多余液体，或用镊子轻敲载玻片排出气泡。
四、染色与标记
1. 染色步骤
- 单一染色法(如亚甲蓝、结晶紫)：滴加染液覆盖样本，染色30秒-2分钟，水洗后吸干。
- 复合染色法(如革兰氏染色)：需严格按顺序操作(初染→媒染→脱色→复染)，脱色时间控制精准。
- 免疫荧光染色：样本需封闭(如BSA孵育)，一抗、二抗依次孵育，避光操作。
2. 标记与记录
- 标记位置：用记号笔在磨砂面标注样本名称、浓度、日期，避免接触样本面。
- 编号规则：采用“日期+样本类型+编号”格式(如20231001-Blood-01)。
五、保存与常见问题
1. 保存条件
- 短期保存：封片后置于干燥盒内，避光防潮。
- 长期保存：用封口膜包裹载玻片，存放于切片盒中，4℃或-20℃保存。
2. 常见问题与解决
- 气泡残留：重新封片或用针头挑破气泡后补封片剂。
- 样本过厚：可能导致显微镜调焦困难，需重新制备更薄样本。
- 污染霉变：样本发霉时用70%乙醇擦拭，重新固定封片。
- 盖玻片碎裂：操作时避免用力不均，选用合适厚度的盖玻片(通常18μm)。
六、特殊实验注意事项
1. 活细胞观察：需使用恒温载物台(37℃)，封片剂选择生理盐水或专用培养基。
2. 原位杂交(FISH)：载玻片需经多聚赖氨酸处理以增强样本附着力。
3. 电子显微镜样本：需将样本包埋于树脂中，载玻片仅用于初步处理。
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