近年来随着光谱流式细胞仪的发展，大大扩展了流式细胞术的分析维度，使得流式实验可同时检测20+参数，为免疫学、肿瘤学、药物研发等生命科学领域的研究工作提供一个高效、得力的工具。

本文主要介绍了一个专门用于研究自然杀伤(NK)细胞的25色光谱流式实验方案。NK细胞是一类负责通过识别特定标志物或其缺失来识别并清除受感染或癌变细胞的免疫细胞亚群（图1）。本研究旨在探究与NK细胞活化、抑制及成熟相关的多种标志物。该光谱实验方案共包含 25 种标志物，并专为 Attune Xenith 全光谱流式细胞仪优化设计，可实现对大量细胞的高速分析。下文中我们总结了该多色方案的实验设计、所选标志物及其在NK细胞研究中的重要性。

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图1. NK细胞通过识别特定细胞标志物的存在与否作出相应反应

Attune Xenith 25色光谱流式实验方案

Attune Xenith 25色光谱流式实验步骤

一、 试剂准备

1. LIVE/DEAD 工作液：

a. 按照说明书制备 LIVE/DEAD Fixable Near IR  876 染料。

b. 取 1 µL LIVE/DEAD Fixable Near IR  876 溶液加到 49 µL 1× PBS 中制备工作液，轻轻上下吹打混匀。

2. 按照说明书制备细胞因子分装液，储存于 -80 ℃ 备用。

a. 加入所选培养基的终浓度将为100 U/mL IL-2、10 ng/mL IL-15 和 25 ng/mL IL-21。

3. 将 AIM-V 培养基放在 37 ℃ 水浴锅中预热。

4. 如需进行细胞刺激：

a. 制备含 5% 热灭活 FBS 和 100 U/mL 青霉素-链霉素双抗的 NK-Xpander 培养基。

b. 放在 37 ℃ 水浴锅中预热。

二、PBMC复苏

1. 将密封良好的冻存 PBMC 冻存管置于 37 ℃ 水浴中约 90 秒，随后每隔 15-20 秒轻轻颠倒混匀 3-4 次，直至瓶内约 75% 内容物呈液态。

2. 从水浴锅中取出 PBMC 冻存管，擦净管外壁残留的水分。

3. 对于每管冻存的PBMC（体积约 1 mL，含约 5×10? 个细胞）：

a. 将 PBMC 轻轻倒入 50 mL 离心管中，加入 10 mL 预热的 AIM-V 培养基。

b. 再向每个 PBMC 瓶中缓慢加入 2 mL AIM-V 培养基，倒入第 3a 步中使用的同一支 50 mL 离心管中，并重复一次。

c. 400×g 离心 5 分钟，轻轻弃去上清液。

d. 用1× PBS重悬 PBMC，并轻轻上下吹打混匀（根据所需细胞浓度，使用 1 ~10 mL 任意体积的 PBS 重悬细胞）。

e. 轻轻颠倒混匀细胞悬液数次，使用 Countess 3 自动细胞计数仪记录细胞浓度及存活率。

注：若细胞存活率低于90%，建议另取一管新的 PBMC，重新制备细胞样本。

三、细胞刺激

1. 分装细胞刺激用的细胞悬液。

a. 将适量体积的细胞悬液分装至各离心管中，建议细胞刺激时使用至少 9×10? 个活细胞。

b. 400×g 离心 5 分钟，轻轻弃去上清液。

c. 将各刺激管中的细胞重悬于 NK-Xpander 培养基中，调整浓度至 3×10? 个活细胞/mL。

d. 将阴性对照（未刺激）管中的细胞重悬于 1× PBS 中，调整浓度至 1×10? 个活细胞/mL，直接进行细胞染色步骤。

2. 向待刺激细胞悬液中加入 IL-2 至终浓度 100 U/mL、IL-15 至 10 ng/mL 以及 IL-21 至 25 ng/mL。

3. 分装至 6 孔细胞培养板中，每孔的最小体积为 1 mL。

4. 37 ℃ 培养箱内孵育 48 小时

a. 48 小时后，将细胞悬液从培养板转移至离心管中，吹打数次混匀。

b. 轻轻颠倒混匀细胞悬液管数次，使用 Countess 3 自动细胞计数仪记录浓度及存活率。

四、细胞染色

1. 用1× PBS重悬PBMC，调整细胞浓度为 1×10? 个活细胞/mL。

2. 轻轻颠倒混匀细胞悬液管数次，用70 μm 细胞滤器过滤至新的 50 mL 离心管中。

3. 制备热激处理的细胞作为细胞活性染料单染对照：

a. 将 1 mL细胞悬液（1×10? 个细胞）加入微量离心管中，置于加热块上，于 65 ℃ 孵育 5 分钟。从加热块上取下，冰上放置 2–3 分钟。

b. 向热块孵育后的冷却微量离心管中加入 500 μL 新鲜制备的PBMC悬液。

4. 分出足量的 PBMC 用于未染色和单染管对照（不加入细胞活性染料）。

5. 向剩余的PBMC悬液中每 1 mL PBMC 加入 1 μL L/D死活染料工作液，轻轻吹打数次混匀。

6. 将所有细胞悬液 4 ℃ 避光孵育 30 分钟。

7. 4 ℃  400×g 离心 5 分钟，弃上清，并用吸水纸短暂接触吸除残留液体。

8. 用eBioscience 流式染色缓冲液重新细胞悬液，调整细胞浓度为 1×10? 个/mL，轻轻吹打混匀。

9. 每 10? 个细胞（即 100 μL 重悬液）悬液中，加入 20 μL 人 BD Fc Block™、10 μL Brilliant stain buffer和 5 μL CellBlox Plus blocking buffer进行封闭处理,轻轻涡旋混匀。

10.  4 ℃避光孵育 15 分钟。

11. 将 100 μL 封闭后的细胞悬液分别转移至各流式管中备用。

a. 样本为经 LIVE/DEAD Fixable Near IR  876 染料染色的批量 PBMC 细胞。

b. 细胞活性单染对照使用热激处理过的染色细胞悬液。

c. 未染色及所有其他单染细胞对照使用未染色的细胞悬液。

12. 向样品管和对照管中加入相应的适量抗体，轻轻涡旋混匀。

13. 4 ℃ 避光孵育 30 分钟。

14. 加入 1 mL eBioscience 流式染色缓冲液洗涤样本。

15. 4 ℃ 400×g 离心 5 分钟，弃上清，并用吸水纸短暂接触以吸除残留液体。

16. 将细胞沉淀重悬于 1 mL eBioscience 流式染色缓冲液中，轻轻吹打混匀。

17.  4 ℃ 400×g 离心 5 分钟，弃上清，用吸水纸短暂接触以吸除残留液体。

18. 将细胞沉淀重悬于 200 μL eBioscience 流式染色缓冲液中，轻轻吹打混匀。

19. 立即上机分析或使用 eBioscience 细胞固定液进行细胞固定。

注：LIVE/DEAD 可固定细胞活性染料可用于新鲜样本，并且在多种固定剂中都能保持稳定。若使用其他细胞活性染料，需在实验前进行测试，确保固定前后死细胞的染色效果一致。

五、实验对照

1. 按照说明书制备 UltraComp eBeads Plus 补偿微球。

2. 使用 eBioscience 细胞固定液进行微球固定或立即上机分析。

注：微球对照的处理方式应与染色的细胞对照一致。如果对照管和样本管细胞进行了固定和/或破膜处理，则需对微球对照进行相同的处理流程。

Attune Xenith 25色光谱流式实验结果

图2. 25色自然杀伤细胞流式方案的设门策略。采用25色流式实验方案分析NK细胞。首先圈出活的淋巴细胞，依次设门排除双联体、死细胞和非NK细胞。最后分析门内具有特定表面标志物的NK细胞。每种颜色对应多色方案中使用的不同荧光标记抗体，从而对NK细胞亚群进行精确鉴定与分析。

图3. 泛NK细胞标志物。不同自然杀伤细胞亚群中 NKp30、NKp46、CD226 和 CD244 的表达情况。

图4. 细胞刺激后泛 NK 细胞标志物的表达变化。当NK细胞用 100 IU/mL  IL-2、10 ng/mL  IL-15 以及 25 ng/mL  IL-21 刺激过夜后，CD11b 或 CD161 的表达水平会发生变化。

图5. NK细胞亚群中的活化标志物。成熟NK细胞群体中表达不同水平的成熟抗原。在病毒感染或肿瘤细胞的刺激过程中，可追踪 NKG2C、CD2 和 CD38 等标志物的表达变化情况。

图6. NK细胞亚群中的抑制性抗原。NKG2A、KIR2DL1、KIR2DL2/3 和 KLRG1 的表达水平如图所示，这些分子在响应肿瘤和病毒感染时调控NK细胞的活化与功能。

图7. NK细胞中活化抗原的表达。当PBMC受到刺激后，NK细胞多种活化标志物的表达水平不尽相同，如 TIGIT、CD69 和 NKp46 。未成熟、成熟及终末NK细胞的表达水平可能存在差异。

图8. 使用25色NK细胞实验方案准确检测稀有细胞亚群。使用Attune Xenith快速采集超过 100 万个细胞 (流速：200 µL/分钟)，用于分析未成熟、成熟及终末NK细胞亚群。第一个图展示了这些细胞亚群占细胞总数的百分比。

光谱流式细胞术讨论

光谱流式细胞术大大扩展了流式实验可同时检测的参数数量，从而可以更深入地研究目标细胞群体。本实验中我们采用 25 色流式方案对人PBMC中的各种NK细胞亚群进行深入分析。通过分析未成熟、成熟及终末 NK 细胞亚群中关键标志物的表达水平，以阐明 NK 细胞活化与抑制状态的表型特征。采用多种标志物标记经细胞因子刺激和未刺激的人 PBMC，结果显示刺激后 NK 细胞亚群的活化指标水平发生显著变化，包括 CD69、NKp46 等在内的多个重要标志物的表达水平与 NK 细胞在此类刺激条件下的预期相符。这有效证实了 Attune Xenith全光谱流式细胞仪及应用的多色流式方案能够精确研究肿瘤免疫中这一重要免疫细胞谱系的能力。

Sasquatch 软件工具和光谱解析结果表明，该多色方案尚未充分发挥Attune Xenith系统的检测潜力。随着光谱流式方案的不断发展，后续研究可以更深入地探索 PBMC 样本中非 NK 细胞的表型特征，以及增加NK 细胞亚群中其他活化/抑制标志物。这一持续改进将进一步提升该多色实验方案在更全面研究免疫细胞亚群方面的实用性。

Attune Xenith 全光谱流式细胞仪

Invitrogen™ Attune™ Xenith™是赛默飞全新推出的一款快速且抗堵的全光谱流式细胞仪，将声波聚焦技术与全光谱解析功能结合，旨在为前沿的科学研究提供一种高效、灵敏、可靠的解决方案。

其主要技术优势为：

· 全光谱：配置高达6激光57参数

· 速度快：上样速度比其他光谱流式仪快5倍

· 抗堵：专业抗堵塞设计

· 灵敏：尤其适合稀有细胞检测

· 自动化：配套流式自动化工作站

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