超敏版人肿瘤坏死因子α(TNF-α) 酶联免疫吸附测定试剂盒

肿瘤坏死因子α（ TNF-α) 简介：

肿瘤坏死因子α（ TNF-α)  由中性粒细胞、活化的淋巴细胞、 巨噬细胞、NK    细胞、LAK细胞、星形胶质细胞内皮细胞、平滑肌细胞和一些转化细胞产生。 小鼠TNF-α以膜锚定的形式出现。 自然发生的TNF-α形式是糖基化的 ，但非   糖基化的重组TNF-α具有相当的生物活性。人类和鼠类的TNF-α在氨基酸水   平上显示出大约79%的同源性。

实验原理：

本试剂盒采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ ELISA） 。往预先包被有人 肿瘤坏死因子α(TNF-α)捕获抗体的微孔中，依次加入样本、标准品、生物素标 记的检测抗体 ，HRP酶结合物 ， 中间经过温育和洗涤 ， 用底物TMB显色 ， TMB在过氧化物酶(HRP)的催化下转化成蓝色 ，并在酸的作用下转化成最终的 黄色。颜色的深浅和样本中的人肿瘤坏死因子α(TNF-α)呈正相关。用酶标仪在 450nm  波长下测定吸光度（ OD值） ，计算样本浓度。

灵敏度：7.65pg/mL

特异性：可检测样本中人的TNF-α ,  且与其类似物无明显交叉反应。

检测范围： 15.62-1000pg/mL

样本稀释：

请提前预估样本的浓度范围 ，如果您的检测样本需要稀释 ，参考稀释方案如下：

稀释 100 倍：一步稀释。取 5μL 样本到 495μL 通用稀释液内 ，做 100 倍稀释；

稀释 1000 倍 ：两步稀释。取 5μL 样本到 95μL 通用稀释液内 ，做 20 倍稀释 ， 再取 5μL 20 倍稀释样本到 245μL 通用稀释液内 ， 做 50 倍稀释 ， 总共稀释 1000 倍；

稀释 100000 倍 ：三步稀释。取 5μL 样本到 195μL 通用稀释液内 ，做 40 倍稀 释 ，再取 5μL 40 倍稀释样本到 245μL 通用稀释液内 ，做 50 倍稀释 ，最后取 5 μL 2000 倍稀释样本到 245μL 通用稀释液内 ，做 50 倍稀释 ，总共稀释 100000 倍；每步稀释时取液量不少于 3μL ，稀释倍数不超过 100 倍。每步稀释都需混合均 匀 ，避免起泡。

1.    从室温平衡10分钟后的铝箔袋中取出所需板条 ，剩余板条用自封袋密封 放回4℃。

2.    加样 ：分别将样本或不同浓度标准品按照100μL每孔加入相应孔中 ，空 白孔加入100μL通用稀释液。盖上封板膜后37℃温育60分钟。（建议：

将待测样本用通用稀释液稀释1倍后再加入酶标板内测试。从而减   少基质效应对测试结果的影响 ，最后计算样本浓度时需乘以对应的稀释 倍数。所有的待测样本和标准品在检测中建议设立复孔）。

3.    加生物素化检抗 ：取出酶标板 ，弃去液体 ，不用洗涤。每孔直接加入

100μL生物素化检抗工作液 ，盖上封板膜后37℃温育60分钟。

4.    洗板 ：弃去液体 ，每孔加入300μL 1x洗涤液 ，静置1分钟 ，甩去洗涤液， 吸水纸上拍干 ，如此重复洗板3次（也可用洗板机洗板）。

5.    加酶结合物工作液 ：每孔加入100μL酶结合物工作液 ，盖上封板膜后 37℃温育30分钟。

6.    洗板 ：弃去液体按步骤4洗涤方法 ，洗板5次。

7.    加底物 ：每孔加入90μL底物(TMB) ，盖上封板膜 ，37℃避光温育15分钟。

8.    加终止液 ：取出酶标板 ，每孔直接加入50μL终止液 ，立即在450nm波长 处测定各孔的OD值。

结果判断：

1.    计算标准品和样本复孔的平均  OD  值并减去空白孔的  OD  值作为校 正值。 以浓度为横坐标 ，OD  值为纵坐标 ，在双对数坐标纸上绘出四参 数逻辑函数的标准曲线。

2.    若样本 OD  值高于标准曲线上限 ，应适当稀释后重测并在计算样本浓度 时乘以相应的稀释倍数。

典型数据和参考曲线：

以下数据和曲线仅供参考 ，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。

注意 ：本图仅供参考 ，应以每次实验数据所绘制标准曲线计算样本含量。

1.    重复性 ：板内变异系数小于  10% ，板间变异系数小于  10%。

2.    回收率 ：在选取的健康人血清、血浆和细胞培养上清中加入  3  个不同 浓度水平的人TNF-α ,  计算回收率。

3.    线性稀释：分别在选取的4份健康人血清、血浆和细胞培养上清中加入

高浓度人TNF-α ,  在标准曲线动力学范围内进行稀释 ，评估线性。