Bryostatin-1 improves function in arteries with suppressed endothelial cell autophagy

Keywords: Aging; Bryostatin-1; Endothelial cell; Nitric oxide.

內(nèi)皮功能障礙是心血管衰老的標(biāo)志，內(nèi)皮細(xì)胞（EC）自噬的下降越來(lái)越被認(rèn)為是導(dǎo)致血管病變的關(guān)鍵因素。以往研究揭示了抑制的 EC 自噬會(huì)破壞 EC 代謝，從而減弱 EC 功能。例如，遺傳或藥理學(xué)自噬受損后的牛（BAECs）和人（HAECs）的動(dòng)脈 EC，以及 EC 自噬受損的老齡小鼠的原代動(dòng)脈 EC，表現(xiàn)出剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的糖酵解通量和 ATP 產(chǎn)生下降。這種表型的后果包括通過(guò)蛋白激酶Cδ（PKCδ）向內(nèi)皮一氧化氮（NO）合酶（eNOS）傳遞的 ATP/ADP 介導(dǎo)的嘌呤能 2Y1 受體（P2Y1R）信號(hào)減少，導(dǎo)致 NO 生成減少。隨后，在具有遺傳、藥理學(xué)和年齡相關(guān)性 EC 自噬損傷的小鼠動(dòng)脈中證明了這一發(fā)現(xiàn)的功能相關(guān)性。通過(guò)體外基因功能獲得和喪失方法，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn) p-PKCδ^T505  作為 P2Y1R 激活和 NO 生成之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈接。這些研究結(jié)果可得出結(jié)論，在與抑制 EC 自噬相關(guān)的環(huán)境中靶向嘌呤能信號(hào)（如衰老）可能是治療并發(fā)內(nèi)皮功能障礙的選擇。

基于此，美國(guó)猶他大學(xué)營(yíng)養(yǎng)與綜合生理學(xué)系、加州大學(xué)大衛(wèi)格芬醫(yī)學(xué)院心臟病學(xué)部及亞利桑那大學(xué)生理學(xué)系團(tuán)隊(duì)研究的重點(diǎn)是確定在與 EC 自噬受損相關(guān)的環(huán)境中尋找該通路中的另一個(gè)節(jié)點(diǎn)是否可能產(chǎn)生功能益處。研究人員試圖通過(guò)驗(yàn)證以下假設(shè)來(lái)識(shí)別上述體外研究結(jié)果的翻譯相關(guān)性：即恢復(fù) PKCδ 信號(hào)可改善腔內(nèi)血流介導(dǎo)的血管舒張，否則在遺傳和生理性 EC 自噬受損的嚙齒動(dòng)物模型中會(huì)受到影響。研究成果發(fā)表于 GeroScience 期刊題為“Bryostatin-1 improves function in arteries with suppressed endothelial cell autophagy”。

早期研究發(fā)現(xiàn)，生理相關(guān)的剪切應(yīng)力會(huì)增加糖酵解 ATP 的產(chǎn)生，導(dǎo)致在轉(zhuǎn)染加擾而非 Atg3 siRNA 的 BAECs 中通過(guò) PKCδ^T505 激活 P2Y1R 介導(dǎo)的 p-eNOS^S1177。支持 PKC 在將自噬依賴性嘌呤能介導(dǎo)的信號(hào)傳遞給 BAECs 中的 eNOS 中起核心作用，其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，剪切誘導(dǎo)的 p-eNOS^S1177 通過(guò)藥理學(xué)（例如苔蘚抑素-1）或遺傳（例如 CA-PKCδ）激活 PKCδ^T505 在自噬受損的 BAECs 中恢復(fù)。因此，研究人員試圖通過(guò)檢驗(yàn)苔蘚抑素-1 恢復(fù)剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的 p-eNOS^S1177 的假設(shè)來(lái)證實(shí) HAECs 中的主要發(fā)現(xiàn)。

Atg3 介導(dǎo) Atg8/LC3I 的脂質(zhì)化形成成熟的 LC3（微管相關(guān)蛋白輕鏈3）-II，是形成成熟自噬體所必需的。接頭蛋白p62（A170/sequestosome-1）連接/運(yùn)送自噬體內(nèi)受損/失調(diào)的細(xì)胞器，并在與溶酶體融合后降解。用 PBS 或 50 nM苔蘚抑素-1 處理的HAECs暴露于0-20 dyne/cm2剪切應(yīng)力下45分鐘。正如預(yù)測(cè)，在轉(zhuǎn)染非靶向但未轉(zhuǎn)染 Atg3 sgRNA 的 HAECs 中，剪切應(yīng)力增加了 LC3-II：GAPDH 積累、p62 降解和 p-eNOS^S1177：eNOS 活化（圖1 A、C-E）。重要的是，轉(zhuǎn)染 Atg3 sgRNA 的 HAECs 用苔蘚抑素-1 處理，剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的 p-eNOS^S1177：eNOS 不影響 LC3-II：GAPDH 或 p62：GAPDH 比值（圖1 B、F-H）。苔蘚抑素-1 處理不影響細(xì)胞死亡或細(xì)胞凋亡。這表明，苔蘚抑素-1 在 Atg3 敲低后恢復(fù) HAECs 中的 p-eNOS^S1177。

圖1    剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的 HAECs 中 p-eNOSS1177 可被 Atg3 敲低抑制，但可被苔蘚抑素-1 恢復(fù)。

體外發(fā)現(xiàn)，苔蘚抑素-1 在遺傳性 EC 自噬受損的情況下恢復(fù)了剪切誘導(dǎo)的 p-eNOS^S1177，這激發(fā)了研究人員使用他莫昔芬誘導(dǎo)的 Atg3 耗竭的成年小鼠的股動(dòng)脈和腦動(dòng)脈研究離體功能相關(guān)性，特別是在 ECs 中。與 WT 小鼠相比，Atg3^EC-/- 的股動(dòng)脈腔內(nèi)血流介導(dǎo)的血管舒張功能減弱，用苔蘚抑素-1 處理股動(dòng)脈恢復(fù)了 Atg3^EC-/- 小鼠血管腔內(nèi)血流介導(dǎo)的血管舒張，表明在這種情況下，NO 對(duì)血管舒張有重要貢獻(xiàn)，苔蘚抑素-1 誘發(fā)的 Atg3^EC-/- 小鼠股動(dòng)脈的改善被L-NMMA（總NOS抑制劑）共孵育阻止。關(guān)于腦動(dòng)脈，苔蘚抑素-1 改善了乙酰膽堿誘發(fā)的血管舒張，而這種舒張?jiān)?span style="font-family: 宋體, SimSun; font-size: 17px;">Atg3^EC-/- 小鼠的前動(dòng)脈（ACA）和中動(dòng)脈（MCA）中會(huì)受到抑制。這些結(jié)果強(qiáng)烈表明，苔蘚抑素-1 在遺傳性 EC 自噬受損的情況下重新激活 p-eNOS^S1177，在一定程度上改善了動(dòng)脈功能。

進(jìn)一步構(gòu)建生理性 EC 自噬抑制模型，即衰老模型。與 7 個(gè)月齡的 C57BL/6 小鼠相比，24 月齡小鼠的原代動(dòng)脈 ECs 的基礎(chǔ)自噬以及剪切誘導(dǎo)的自噬通量、糖酵解、ATP 產(chǎn)生、p-eNOS^S1177 和 NO 的產(chǎn)生較低。與成年小鼠相比，老年小鼠股動(dòng)脈中腔內(nèi)血流介導(dǎo)的血管舒張受損，這種損害在L-NMMA同時(shí)治療的成年小鼠的動(dòng)脈中也得到了再現(xiàn)。值得注意的是，苔蘚抑素-1 以 L-NMMA 敏感的方式使老年小鼠動(dòng)脈中血流介導(dǎo)的血管舒張正?；▓D2 A）。內(nèi)皮獨(dú)立功能（圖2 B）以及非受體和受體介導(dǎo)的血管收縮在成年小鼠和老年小鼠之間相似。關(guān)于腦動(dòng)脈，苔蘚抑素-1 改善了乙酰膽堿誘發(fā)的血管舒張，而這種舒張?jiān)?老年小鼠與成年小鼠 MCA （圖2 C）和 ACA （圖2 E）中會(huì)受到抑制。這證實(shí)早期的發(fā)現(xiàn)，即兩組MCAs （圖2 D）和 ACAs（圖2 F）中的血管平滑肌功能相似。這些數(shù)據(jù)表明，苔蘚抑素-1 改善老齡小鼠的動(dòng)脈功能。

圖2     老年小鼠與成年小鼠的股動(dòng)脈和腦動(dòng)脈中的內(nèi)皮依賴性血管舒張受損，但可通過(guò)苔蘚抑素-1 恢復(fù)。

目前為止，研究觀察到苔蘚抑素-1 恢復(fù)了剪切誘導(dǎo)的 p-eNOS^S1177，否則會(huì)被 EC 自噬受損阻止，并且這一發(fā)現(xiàn)具有功能相關(guān)性，因?yàn)樘μ\抑素-1 改善了遺傳和生理性EC自噬受損模型中的內(nèi)皮功能?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，研究假設(shè)苔蘚抑素-1 通過(guò)激活 p-PKCδ^T505 刺激 ECs 中的 p-eNOS^S1177。結(jié)果觀察到，苔蘚抑素-1 提高了 p-PKCδ^T505 及其下游靶標(biāo) p-PKD^S744/S748、p-PKD^S916 和 p-eNOS^S1177，這可以通過(guò)使用 10 μM Rottlerin 抑制 p-PKCδ^T505  來(lái)消除（Rottlerin是有報(bào)道的PKCδ抑制劑）。這表明，苔蘚抑素-1 介導(dǎo)的 p-eNOS^S1177 激活對(duì) PKC 抑制敏感。

由于觀察到苔蘚抑素-1 誘導(dǎo)的 PKD 激活明顯比 PKCδ^T505 上調(diào)更穩(wěn)健（圖3 A-D），并且 Rottlerin 在其他細(xì)胞類型中被報(bào)道發(fā)揮脫靶效應(yīng)，研究推斷抑制 PKD 可能是評(píng)估在該通路中操縱該節(jié)點(diǎn)的功能后果的最佳方法。因此，使用細(xì)胞系統(tǒng)方法研究了 CRT0066101 抑制 PKD 激活的功效。在 HAECs 中，苔蘚抑素-1 誘導(dǎo)的 p-PKD^S744/S748、p-PKD^S916 和 p-eNOS^S1177 被 CRT 處理同時(shí)消除（圖3 A-D）?；谶@些結(jié)果，在沒(méi)有和有 CRT 的情況下完成了腔內(nèi)血流介導(dǎo)的血管舒張實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估 PKD 抑制的功能后果。結(jié)果表明，在苔蘚抑素-1 存在的情況下，通過(guò)與 PKD 抑制劑 CRT 同孵育，腔內(nèi)血流介導(dǎo)的血管舒張?jiān)诰哂羞z傳性（圖3 E）或衰老相關(guān)（圖3 F）的 EC自噬受損的小鼠的動(dòng)脈中被阻止，并且在兩種模型中血管平滑肌功能都完好無(wú)損（圖3 G）。苔蘚抑素-1 改善了老年小鼠的實(shí)質(zhì)小動(dòng)脈血管舒張（圖3 H）。這些數(shù)據(jù)表明，苔蘚抑素-1 激活 PKC/PKD 信號(hào)以改善 EC 自噬受抑制的小鼠的動(dòng)脈功能。

圖3     CRT0066101 可減弱苔蘚抑素-1 誘導(dǎo)的 p-PKDS744/748、p-PKDS916、p-eNOSS1177 和腔內(nèi)血流介導(dǎo)的血管舒張。

圖4   圖形概要

總之，該研究表明，剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的 eNOS（p-eNOSS1177）磷酸化激活被 PKC 激動(dòng)劑苔蘚抑素-1 恢復(fù)，否則會(huì)因敲低 ECs 中的自噬相關(guān)基因3（Atg3）而抑制；在遺傳和年齡相關(guān)的 EC 自噬受損的小鼠模型中，苔蘚抑素-1 可以逆轉(zhuǎn)股動(dòng)脈和腦動(dòng)脈顯示的血管舒張抑制；苔蘚抑素-1 激活 PKC/PKD 信號(hào)以改善 EC 自噬受抑制的小鼠的動(dòng)脈功能。這些發(fā)現(xiàn)提供了證據(jù)，證明刺激 PKC/PKD 具有恢復(fù)與 EC 自噬抑制相關(guān)的受損內(nèi)皮功能的戰(zhàn)略潛力，如衰老。

參考文獻(xiàn)：Cho JM, Park SK, Mookherjee S, Peters EC, Pires PW, Symons JD. Bryostatin-1 improves function in arteries with suppressed endothelial cell autophagy. Geroscience. 2025 Apr 12. doi: 10.1007/s11357-025-01650-5. Epub ahead of print. PMID: 40220153.

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