（一）神經(jīng)類(lèi)器官培養(yǎng)步驟

神經(jīng)類(lèi)器官的培養(yǎng)過(guò)程涉及多個(gè)階段，包括誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）的分化、神經(jīng)祖細(xì)胞（NPCs）和小膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞（MGPs）的生成、類(lèi)器官的組裝以及長(zhǎng)期培養(yǎng)。

1. iPSCs的分化

   - 皮質(zhì)神經(jīng)元分化：

     - 第0天：用Accutase消化iPSCs，以2.5×10^5細(xì)胞/cm2的密度接種到Geltrex涂層的六孔板上。

     - 第1-11天：每天用含有SB、LDN和Cyclopamine的基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，形成單層細(xì)胞。

     - 第12天：將細(xì)胞傳代到新的Geltrex涂層板上，繼續(xù)培養(yǎng)。

     - 第13-19天：將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基中，每天更換培養(yǎng)基。

     - 第19天：再次傳代，繼續(xù)用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。

     - 第25天：完成皮質(zhì)祖細(xì)胞的分化。

   - 多巴胺神經(jīng)元分化：

     - 第0天：從Geltrex上生長(zhǎng)的iPSCs開(kāi)始，轉(zhuǎn)移到D0培養(yǎng)基中。

     - 第1-11天：按照預(yù)定的培養(yǎng)基配方進(jìn)行培養(yǎng)基更換。

     - 第13天：將細(xì)胞傳代到聚-L-鳥(niǎo)氨酸（PO）和層粘連蛋白（LAM）涂層的板上。

     - 第15-20天：用含有ROCK抑制劑的培養(yǎng)基維持細(xì)胞，每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)基。

     - 第20-24天：細(xì)胞開(kāi)始呈現(xiàn)雙極形態(tài)，再次傳代。

     - 第25天：完成多巴胺祖細(xì)胞的分化。

 2. 小膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞（MGPs）的生成

   - 使用已有的高效、可重復(fù)的iPSC衍生小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方案，如Douvaras等人或Fattorelli等人的方法。

   - 在分化過(guò)程中，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD14+CX3CR1+ MGPs的表達(dá)，確保小膠質(zhì)細(xì)胞的生成。

3. 類(lèi)器官的組裝

   - 第25天：將神經(jīng)祖細(xì)胞（NPCs）與小膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞（MGPs）按比例混合（例如，100,000 NPCs與20,000 MGPs），在96孔V型底板中形成類(lèi)器官。

   - 第1天：觀察類(lèi)器官的形成，并進(jìn)行第一次培養(yǎng)基更換。

   - 第7天：類(lèi)器官準(zhǔn)備好后，轉(zhuǎn)移到密封的冷凍管中，用于長(zhǎng)期培養(yǎng)或太空運(yùn)輸。

4. 長(zhǎng)期培養(yǎng)和太空運(yùn)輸

   - 將類(lèi)器官轉(zhuǎn)移到冷凍管中，加入足夠的培養(yǎng)基以避免營(yíng)養(yǎng)耗盡。

   - 使用便攜式孵化器或冷鏈運(yùn)輸將冷凍管運(yùn)往航天中心。

   - 在國(guó)際空間站（ISS）上，類(lèi)器官在密封管中培養(yǎng)，無(wú)需培養(yǎng)基或二氧化碳交換。

（二）北京基爾比生物公司研制生產(chǎn)的微重力3D細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的影響

微重力對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的影響是本文研究的重點(diǎn)之一。研究結(jié)果表明，微重力可能對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生以下影響：

1. 免疫細(xì)胞活性增加

   - 研究表明，微重力會(huì)增加免疫細(xì)胞的活性，這可能影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的小膠質(zhì)細(xì)胞功能。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)的免疫細(xì)胞，負(fù)責(zé)清除病原體和細(xì)胞碎片。在微重力環(huán)境下，小膠質(zhì)細(xì)胞的活性可能被激活，從而影響神經(jīng)炎癥的進(jìn)程。

2. 神經(jīng)退行性疾病的加劇

   - 微重力可能加劇神經(jīng)退行性疾病的病理機(jī)制。例如，多發(fā)性硬化癥（MS）和帕金森病（PD）的病理特征可能在微重力環(huán)境下變得更加明顯。研究者通過(guò)將來(lái)自這些疾病患者的iPSCs分化為神經(jīng)祖細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞，并在微重力環(huán)境下培養(yǎng)類(lèi)器官，觀察到微重力可能加劇了這些疾病的病理特征。

3. 神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的變化

   - 微重力可能影響神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。例如，神經(jīng)元的突起生長(zhǎng)和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成可能受到微重力的影響。在微重力環(huán)境下，神經(jīng)元的電生理活動(dòng)也可能發(fā)生變化，這可以通過(guò)多電極陣列（MEA）進(jìn)行檢測(cè)。

4. 細(xì)胞代謝和基因表達(dá)的改變

   - 微重力可能影響細(xì)胞的代謝和基因表達(dá)。通過(guò)RNA測(cè)序和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，研究者可以檢測(cè)微重力對(duì)神經(jīng)細(xì)胞基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成的影響。這些變化可能與神經(jīng)炎癥和神經(jīng)退行性疾病的病理機(jī)制有關(guān)。

（三）地面模擬利器，Kilby Gravity系統(tǒng)的技術(shù)突破

太空實(shí)驗(yàn)機(jī)會(huì)稀缺且昂貴，地面模擬微重力平臺(tái)成為研究的關(guān)鍵支撐。北京基爾比生物科技公司的Kilby Gravity重力模擬控制裝置提供了可及性強(qiáng)、精確度高的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

該系統(tǒng)核心技術(shù)在于三維隨機(jī)旋轉(zhuǎn)重力矢量分散機(jī)制。通過(guò)雙軸獨(dú)立控制旋轉(zhuǎn)系統(tǒng)，使培養(yǎng)容器內(nèi)的重力矢量在空間快速隨機(jī)化，實(shí)現(xiàn)持續(xù)的10?3g微重力環(huán)境模擬——接近國(guó)際空間站的實(shí)際微重力水平。

北京基爾比生物科技公司的Kilby Gravity微重力培養(yǎng)系統(tǒng)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)在于多功能集成與實(shí)時(shí)監(jiān)控能力。設(shè)備內(nèi)置傳感器，可實(shí)時(shí)監(jiān)控并可視化重力水平；旋轉(zhuǎn)器主體緊湊設(shè)計(jì)可放入標(biāo)準(zhǔn)CO2培養(yǎng)箱，維持細(xì)胞培養(yǎng)的溫濕度和氣體環(huán)境。

北 京 基 爾 比 生物科技公司主營(yíng)產(chǎn)品：

Kilby 3D-clinostat 旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)儀，

Kilby Gravity 微/超重力三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，

3D回轉(zhuǎn)重力環(huán)境模擬系統(tǒng)，隨機(jī)定位儀，

類(lèi)器官芯片搖擺灌注儀，

Kirkstall Quasi Vivo 類(lèi)器官串聯(lián)芯片仿生系統(tǒng)