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双特异性抗体（bispecific antibody,BsAb）是指含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，可以同时与靶细胞和功能细胞进行相互作用，进而增强肿瘤细胞杀伤功能。近年，双抗迎来研发热潮，截至2024年底，全球已有19款双抗药物获批上市，在研双抗药物数量达数百款。双抗主要通过基因重组技术进行生产，有多种多样的分子设计类型，满足双抗分子识别两种不同抗原的能力。
其中IgG-like 的双特导性抗体在表达中，理论上会伴随产生10种以上的副产物，主要包括重链之间错配引起的同源抗体（homodimer Fc species）轻链与重链之间错配引起的异源抗体（heterodimeric Fc species）结构不完整的片段抗体、如半抗（half antibody）或3/4抗体、以及轻链聚集体（light chain dimer）重链聚集体（heavy chain dimer）等等。参见示意图1。
图1. 双特异性 mAb 表达中轻重链区域的可能组合
科学家们已经找出多种巧妙的分子设计策略来降低上述副产物的产生。其中，经典的要属降低重链同源错配的 KiH，即 Knob-into-hole 技术，以及降低轻链重链错配的 CrossMab 技术。然而，所有分子设计策路都只能尽量降低某类副产物的产生，而不能消除全部的副产物。不仅如此，在双抗的重组表达过程，还不可避免的会产生不完整的片段抗体以及聚集体。所有这些都给双抗分子的下游工艺开发提出了挑战。
面对这个问题，Biozen dSEC2色谱柱尝试通过对一种lgG-like类型双抗分子（Vudalimab）进行纯度分析，尝试分离几类主要的副产物，比如homodimer, half antibody, light chain related impurity aggregate 等[1]。
Vudalimab （分子量约 125.43 kDa）是一种YBODY®平台工艺生产的二价（1:1）非对称性的结构; 具体为靶向抗原A的单元Fab-Fc和靶向抗原B的单链单元ScFv-Fc 组成 (Fab-ScFv-Fc) （参见图2）。单元A和单元B在二者Fc-CH3之间通过盐桥（Salt-Bridge）和“杵入臼”（Knob-into-Hole）等工程改造以有效形成目标双抗体（heterodimer），并在铰链区（hinge region）形成稳定的链间二硫键。这些对Fc 的工程改造大大提高了目标双抗分子的占比，保证了双抗体生产的高产率以及工艺和产品的稳定性。
图2. Vudalimab PD-1 × CTLA-4 双抗示意图[2]
在Biozen dSEC-2（3um，7.8x300mm） 色谱柱上的分析结果可见：通过和蛋白标准品对比，Vudalimab的洗脱时间略晚于分子量150kDa的human IgG的洗脱时间；放大看Vudalimab的HMWS部分可以看到有至少三种不同分子量分布。推测为Homodimer错配，目标双抗聚集体和Homodimer的聚集体等。参见图3。
图3. Vudalimab的聚集体和Aqueous SEC check standard的叠图
Biozen dSEC-2的高亲水性改性的硅胶修饰技术结合钛合金的柱硬件使得和生物大分子的次级作用得到改善，另外，dSEC-2有的孔控制技术也使得这款色谱柱具有柱床稳定，耐压，批次重现性好的特点。
参考文献
[1]. Cytiva：双抗的纯化策略
[2]. Mark N. Stein, et, al. A Phase 2 Study of Vudalimab, a PD-1 × CTLA-4 Bispecific Antibody, Plus Chemotherapy or Targeted Therapy in Patients with Molecularly Defined Subtypes of Metastatic Castration-Resistant Prostate Cancer.
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