Mechanically activated mesenchymal-derived bone cells drive vessel formation via an extracellular vesicle mediated mechanism

Keywords: Osteoblast; VEGF; angiogenesis; mechanobiology; miRNA; miRNA-150-5p; osteocyte.

血管生成是成人骨骼發(fā)育、重塑和修復(fù)過程中骨形成的重要初始步驟。這導(dǎo)致組織高度血管化，其中內(nèi)皮細(xì)胞和骨骼細(xì)胞不斷處于串?dāng)_狀態(tài)以促進(jìn)體內(nèi)平衡，這一過程由許多環(huán)境信號(hào)介導(dǎo)，包括機(jī)械負(fù)荷。這種通訊的中斷會(huì)導(dǎo)致疾病和/或骨折修復(fù)不良。

間充質(zhì)干細(xì)胞/基質(zhì)細(xì)胞（MSC）分泌蛋白組的促血管生成作用已得到充分證實(shí)，并且是許多利用這種細(xì)胞類型進(jìn)行組織修復(fù)的細(xì)胞療法的驅(qū)動(dòng)力。有趣的是，MSC 分泌蛋白組的促血管生成特性在機(jī)械負(fù)荷后增強(qiáng)。成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞也被證明可以調(diào)節(jié)血管生成，表明成骨譜系的細(xì)胞可以協(xié)調(diào)血管形成。此外，雖然成骨細(xì)胞的機(jī)械激活進(jìn)一步增強(qiáng)了分泌蛋白組的血管生成特性，但目前尚不清楚骨細(xì)胞是否也具有相同的機(jī)械驅(qū)動(dòng)反應(yīng)。

細(xì)胞外囊泡（EVs）是一組高度異質(zhì)性的細(xì)胞衍生脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，參與多種生理和病理過程，已成為許多組織（包括骨組織）中細(xì)胞間通訊的有效介質(zhì)。骨細(xì)胞已被證明可以釋放促成骨 EV，這些 EV 的再生效力取決于親本細(xì)胞的機(jī)械激活。然而，成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞衍生的 EVs 的血管生成特性仍然未知。因此，EVs 代表了成熟骨細(xì)胞介導(dǎo)血管生成的潛在機(jī)制。

基于此，愛爾蘭都柏林圣三一生物醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了深入研究，首先確定成熟骨骼細(xì)胞（成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞）是否可以調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管生成，以及這個(gè)過程是否受到機(jī)械調(diào)節(jié)；其次，研究這種潛在的促血管生成旁分泌信號(hào)是否可以通過細(xì)胞外囊泡的分泌來介導(dǎo)；最后，探索 EVs 可能通過包裹和遞送促血管生成介質(zhì)介導(dǎo)血管生成反應(yīng)的潛在機(jī)制。這項(xiàng)研究代表對(duì)骨骼中成骨和血管生成的復(fù)雜耦合的進(jìn)一步見解，并表明骨源性 EVs 作為新型血管生成療法的潛力。研究成果發(fā)表于 Journal of Tissue Engineering 期刊題為“Mechanically activated mesenchymal-derived bone cells drive vessel formation via an extracellular vesicle mediated mechanism”。

為了確定成熟骨骼細(xì)胞是否可以協(xié)調(diào)血管生成，首先對(duì)骨樣細(xì)胞MLO-Y4與成骨樣細(xì)胞MC3T3 細(xì)胞系施加機(jī)械剪切刺激（0-3.2?dyne/cm2），檢查了響應(yīng)從靜態(tài)培養(yǎng)和機(jī)械活化成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞收集的條件培養(yǎng)基中的 HUVEC 增殖和募集，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖不受從靜態(tài)培養(yǎng)的成骨細(xì)胞或骨細(xì)胞（S-CM）收集的條件培養(yǎng)基的影響，然而，在機(jī)械刺激成熟骨骼細(xì)胞后，與沒有VEGF培養(yǎng)基的對(duì)照組相比，用來自成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的機(jī)械激活條件培養(yǎng)基（MA-CM）處理時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞增殖顯著增加。內(nèi)皮細(xì)胞的募集同樣受到成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的影響。靜態(tài)培養(yǎng)的成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的條件培養(yǎng)基引起內(nèi)皮細(xì)胞遷移的小幅度增加，然而，在成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的機(jī)械激活后，與沒有VEGF培養(yǎng)基的對(duì)照組相比，內(nèi)皮細(xì)胞募集顯著增加。雖然 MA-CM 對(duì)內(nèi)皮增殖的影響與 VEGF 相似，但在募集方面，VEGF 在兩種類型的成熟骨骼細(xì)胞中均顯著優(yōu)于 CM。（VEGF 是一種促血管生成因子，在所有測(cè)定中均用作陽性對(duì)照。）這些數(shù)據(jù)表明，經(jīng)受機(jī)械刺激的成熟骨骼細(xì)胞釋放的旁分泌因子可以增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和募集，為早期血管生成做準(zhǔn)備。

隨后，檢查了從靜態(tài)培養(yǎng)和機(jī)械激活的成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞收集的條件培養(yǎng)基對(duì) HUVEC 管形成的反應(yīng)（圖1）。與無 VEGF 對(duì)照相比，用 10 ng/mL VEGF 處理 18 小時(shí)后，明顯可見清晰的小管樣形成（圖1 a）。圖像定量后發(fā)現(xiàn)，VEGF 處理顯著增強(qiáng)了分支的形成、管長(zhǎng)和連接密度，證明這種細(xì)胞類型如前所述具有血管生成的能力（圖1 b、c）。

用從靜態(tài)培養(yǎng)的成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中收集的 CM 以 1：1 的比例補(bǔ)充 HUVEC 培養(yǎng)基以分析管形成。在靜態(tài)培養(yǎng)的成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的補(bǔ)充組中，18 小時(shí)后沒有明顯的血管生成證據(jù)（圖1 a、b、c）。有趣的是，在補(bǔ)充機(jī)械激活的成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞 CM 后，兩組的管形成都很明顯，且與補(bǔ)充 VEGF 時(shí)情況相同（圖1 a）。此外，圖像量化顯示，與無 VEGF 陰性對(duì)照和靜態(tài)培養(yǎng)的骨骼細(xì)胞 CM 相比，用機(jī)械激活的成熟骨骼細(xì)胞 CM 處理導(dǎo)致分支數(shù)量、管長(zhǎng)和連接密度在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著增加（圖1 b、c）。這些數(shù)據(jù)表明，成熟骨骼細(xì)胞通過機(jī)械刺激后的旁分泌機(jī)制驅(qū)動(dòng)血管生成。

圖1     機(jī)械激活的成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞通過旁分泌機(jī)制誘導(dǎo) HUVEC 中的血管形成。

接下來，研究了 EVs 是否可能在機(jī)械刺激后成熟骨骼細(xì)胞血管生成的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。使用超速離心法從成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的 CM 中收集 EVs 并對(duì)其進(jìn)行表征，數(shù)據(jù)表明骨樣細(xì)胞MLO-Y4與成骨樣細(xì)胞MC3T3 細(xì)胞系分泌的細(xì)胞外囊泡大小、數(shù)量和表面標(biāo)記物表達(dá)相似。

為了評(píng)估機(jī)械激活的骨細(xì)胞衍生的 EVs（MA-EVs）對(duì)血管生成的潛在影響，用從機(jī)械激活的成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞 CM 中分離的 EVs 處理 HUVECs。此外，還用耗盡 EVs 的 MA-CM 處理 HUVECs，以確定培養(yǎng)基內(nèi)的可溶性因子是否可能引起血管生成反應(yīng)。有趣的是，先前增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞 MA-CM 在培養(yǎng)基中耗盡細(xì)胞外囊泡后沒有引起任何顯著反應(yīng)。然而，利用從機(jī)械激活的成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞-CM 中分離的 EVs，可以看到內(nèi)皮增殖顯著增加。在內(nèi)皮細(xì)胞的募集方面，與無 VEGF 對(duì)照相比，成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中耗盡 EVs 的 MA-CM 引起內(nèi)皮細(xì)胞遷移的小幅度增加，而從成骨細(xì)胞 MA-CM 中分離的 EV 誘導(dǎo)了遷移更強(qiáng)烈的增加。然而，與耗盡 EV 的 MA-CM 或 VEGF 對(duì)照相比，從骨細(xì)胞 MA-CM 中分離的 EVs 不會(huì)進(jìn)一步影響內(nèi)皮細(xì)胞募集。這些數(shù)據(jù)表明，經(jīng)受機(jī)械刺激的成熟骨骼細(xì)胞釋放的細(xì)胞外囊泡可以增強(qiáng)增殖，并在一定程度上增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的募集，為早期血管生成做準(zhǔn)備。

進(jìn)一步檢測(cè)了響應(yīng)機(jī)械活化成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞分泌的 EVs 的 HUVEC 管形成（圖2 a）。先前增強(qiáng)血管生成的成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞 MA-CM 在培養(yǎng)基中耗盡細(xì)胞外囊泡后沒有引起任何顯著反應(yīng)（圖2 a、b、c）。然而，在補(bǔ)充從成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞 CM 中分離的機(jī)械激活的 EVs 后，兩組的管形成都很明顯，且與 VEGF 陽性對(duì)照中觀察到的情況相同（圖2 a）。此外，圖像的量化顯示，與無 VEGF 陰性對(duì)照和機(jī)械激活的 EVs 耗盡的骨骼細(xì)胞 CM 相比，用機(jī)械激活的 EVs 處理導(dǎo)致的分支數(shù)量、管長(zhǎng)和連接密度在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著增加（圖2 b、c），但骨細(xì)胞衍生的 MA-EVs 處理后的連接密度除外。這些數(shù)據(jù)表明，成熟骨骼細(xì)胞通過機(jī)械刺激后的 EV 釋放機(jī)制驅(qū)動(dòng)血管生成。

圖2     機(jī)械激活的成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞釋放的細(xì)胞外囊泡誘導(dǎo) HUVEC 中的血管形成。

令人驚訝的是，從靜態(tài)培養(yǎng)或機(jī)械激活的成骨細(xì)胞收集的 CM 中的 VEGF 水平幾乎檢測(cè)不到（圖3 a）。雖然機(jī)械刺激確實(shí)使成骨細(xì)胞分泌組中 VEGF 的濃度提高了 ~1.5 倍，但這并不顯著。同樣，成骨細(xì)胞來源的 MA-EVs 和耗盡 EV 的成骨細(xì)胞 MA-CM 也含有可忽略不計(jì)的 VEGF 量。相比之下，骨細(xì)胞分泌更高濃度的 VEGF （圖3 c），機(jī)械刺激更將其提高了 1.8 倍。有趣的是，在骨細(xì)胞來源的 MA-EV 中幾乎沒有檢測(cè)到 VEGF，所有 VEGF 都在耗盡 EVs 的 MA-CM 中檢測(cè)到，這表明 VEGF 在細(xì)胞釋放之前沒有特異性包裹在 EVs 中。這些數(shù)據(jù)表明，成熟的骨骼細(xì)胞，特別是骨細(xì)胞，分泌促血管生成因子 VEGF，并且這種分泌受到機(jī)械調(diào)節(jié)，但不包裹在細(xì)胞外囊泡內(nèi)。

由于細(xì)胞外囊泡已被證明可以通過 miRNA 的包裹和遞送來介導(dǎo)通訊，其中許多是已知的血管生成的調(diào)節(jié)因子，因此研究了 MA-EVs 中的 miRNA 載物。使用高通量測(cè)序（miRNA-seq）對(duì)靜態(tài)培養(yǎng)和機(jī)械刺激的骨細(xì)胞釋放的細(xì)胞外囊泡內(nèi)的 miRNA 進(jìn)行分析，其中122 個(gè) miRNA 顯示出強(qiáng)表達(dá)信號(hào)。功能過表達(dá)分析（ORA）發(fā)現(xiàn)，與基因本體類別相關(guān)的 miRNA 顯著富集，如血管重塑、細(xì)胞增殖和血管生成的正調(diào)控。差異表達(dá)分析揭示了兩種不同的 miRNA，與來自靜態(tài)培養(yǎng)的骨細(xì)胞條件培養(yǎng)基的 EV 相比，它們?cè)?MA-EV 中顯著上調(diào)（mmu-miR-150-5p 和 mmu-miR-2137）。這些數(shù)據(jù)表明，骨細(xì)胞釋放含有與血管生成相關(guān)的 miRNAs 的細(xì)胞外囊泡，這些 miRNAs 在機(jī)械刺激下增加。

圖3    成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞分泌低水平的 VEGF，該 VEGF 是機(jī)械調(diào)節(jié)的，獨(dú)立于細(xì)胞外囊泡。

總之，該研究展示了一種新的機(jī)制，即機(jī)械負(fù)荷通過從成熟骨骼細(xì)胞（如成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞）釋放細(xì)胞外囊泡來調(diào)節(jié)血管形成。這為研究機(jī)械激活的骨骼細(xì)胞衍生的細(xì)胞外囊泡作為一種促進(jìn)血管生成和組織再生的新型療法開辟了一條新途徑。因此，骨細(xì)胞 MA-EV 可能代表一種多靶點(diǎn)療法，可通過全身或局部遞送進(jìn)行組織修復(fù)。

參考文獻(xiàn)：Shen N, Maggio M, Woods I, C Lowry M, Almasri R, Gorgun C, Eichholz KF, Stavenschi E, Hokamp K, Roche FM, O'Driscoll L, Hoey DA. Mechanically activated mesenchymal-derived bone cells drive vessel formation via an extracellular vesicle mediated mechanism. J Tissue Eng. 2023 Aug 29;14:20417314231186918. doi: 10.1177/20417314231186918. PMID: 37654438; PMCID: PMC10467237.

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