一、背景

人胚腎上皮包裝細(xì)胞是在293細(xì)胞株上插入免疫缺陷病毒SV40 T-抗原基因后產(chǎn)生的高轉(zhuǎn)染效率衍生株，廣泛用于包裝慢病毒，其轉(zhuǎn)染效率比293細(xì)胞高很多，是研究基因功能的一個(gè)強(qiáng)大工具。

二、人胚腎上皮包裝細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程

1、人胚腎上皮包裝細(xì)胞培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備DMEM培養(yǎng)基(DMEM，GIBCO，貨號11965-092)，90%；胎牛血清，10%。

2）人胚腎上皮包裝細(xì)胞培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）人胚腎上皮包裝細(xì)胞凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲存。

2、人胚腎上皮包裝細(xì)胞處理：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）人胚腎上皮包裝細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3ml此細(xì)胞的培養(yǎng)基終止消化。

3.輕輕吹打后吸出，移入15ml離心管中，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.移入到事先準(zhǔn)備好的含有5ml培養(yǎng)基的T-25培養(yǎng)瓶中或含有14ml培養(yǎng)基的T-75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

3）人胚腎上皮包裝細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，先要消化處理并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。消化方法按照細(xì)胞傳代方法的1-3步驟進(jìn)行，最后的重懸液使用血清。懸浮細(xì)胞直接計(jì)數(shù)后離心，用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中。

三、應(yīng)用

人胚腎上皮包裝細(xì)胞可以用于NF-κB轉(zhuǎn)錄因子報(bào)告基因系統(tǒng)的構(gòu)建優(yōu)化及在篩選促TRAIL抗腫瘤藥物中的應(yīng)用：

從抑制TRAIL激活的促存活信號通路NF-κB角度著手,嘗試增強(qiáng)TRAIL抗腫瘤的活性。

分為以下四個(gè)部分：

1)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子報(bào)告基因系統(tǒng)的構(gòu)建及優(yōu)化;

2)利用該系統(tǒng)篩選能下調(diào)NF-κB表達(dá)量或抑制NF-κB活性的中藥成分;

3)將2)中篩選出的中藥成分與TRAIL聯(lián)用,檢測其對A549、COLO205等腫瘤細(xì)胞的殺傷效果;

4)對3)中中藥成分促進(jìn)TRAIL抗腫瘤活性機(jī)制進(jìn)行初步探索。

研究方法與結(jié)果：

1、穩(wěn)定表達(dá)NF-κB轉(zhuǎn)錄因子熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)的構(gòu)建及驗(yàn)證。

利用分子克隆的酶切、連接等基本操作,先將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pQCXIP原有的CMV啟動(dòng)子去除,再分別插入NF-κB增強(qiáng)子序列以及熒光素酶NanoLuc(NLuc)報(bào)告基因序列,構(gòu)建了受轉(zhuǎn)錄因子NF-κB調(diào)控的熒光素酶NLuc報(bào)告基因表達(dá)載體pQCXIP-NF-κB-NLuc。將構(gòu)建的pQCXIP-NF-κB-NLuc質(zhì)粒與病毒包裝質(zhì)粒pVSVG一起用陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人胚腎上皮包裝細(xì)胞GP2-293細(xì)胞系制備相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒,侵染人宮頸癌細(xì)胞系HeLa,通過嘌呤霉素篩選出表達(dá)相應(yīng)抗性基因的陽性細(xì)胞,并進(jìn)一步篩選出對NF-κB通路陽性刺激物TNFα最敏感的細(xì)胞克隆。該細(xì)胞株對TNFα的刺激呈現(xiàn)出濃度梯度、時(shí)間依賴性,表明受NF-κB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的穩(wěn)定表達(dá)NLuc熒光素酶的細(xì)胞系PP-NF-κB-NLuc-HeLa構(gòu)建成功,可用于定量檢測NF-κB的活化效果及篩選與NF-κB活化調(diào)控相關(guān)的藥物等。

2、優(yōu)化構(gòu)建的熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測方式。

在上述構(gòu)建好的熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)的應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基的pH、培養(yǎng)基中的血清對NLuc熒光素酶的檢測有影響,對于后續(xù)藥物調(diào)控功能的檢測存在不利影響,因此在初步確定了pH及血清的原因后,選取了NLuc熒光素酶發(fā)光強(qiáng)度較強(qiáng)及相對穩(wěn)定的添加0.03%(V/V)Triton X-100的PBS緩沖液(PBST)作為Nluc酶的檢測體系。

3、篩選下調(diào)NF-κB的中藥成分。在成功完成了系統(tǒng)的構(gòu)建及NLuc熒光素酶的檢測體系優(yōu)化后,利用該系統(tǒng)對36種中藥粗提物或單體進(jìn)行了檢測,并初步篩選出了12種能降低NF-κB活性或下調(diào)NF-κB表達(dá)量的中藥粗提物或單體,在排除了有強(qiáng)細(xì)胞毒性的、有相關(guān)與TRAIL聯(lián)用抗腫瘤報(bào)道的、促腫瘤增殖的成分等之后,最終選取了QD6-4、SKN兩種中藥單體進(jìn)一步研究其與TRAIL的聯(lián)用的效果。

4、篩選到的中藥單體與TRAIL聯(lián)用對腫瘤的殺傷檢測。細(xì)胞活力檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,兩種單體分別與TRAIL聯(lián)用作用于人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549及結(jié)直腸癌細(xì)胞系COLO205細(xì)胞后,QD6-4對這兩個(gè)細(xì)胞系幾乎無任何促進(jìn)TRAIL抗腫瘤活性的作用,SKN對COLO205幾乎無作用,但能顯著增強(qiáng)TRAIL對A549的殺傷,且在SKN使用濃度為2-8μM時(shí)有協(xié)同效果。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SKN對人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116、人宮頸癌細(xì)胞系HeLa、人胰腺癌細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞系也均表現(xiàn)出了促進(jìn)TRAIL殺傷的效果,其中在使用濃度為2-8μM時(shí)對HeLa和PANC-1細(xì)胞的殺傷作用均表現(xiàn)出了協(xié)同效果,且對PANC-1細(xì)胞系的協(xié)同效果尤為明顯。

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