免疫印迹（Western blot, WB）是分子生物学中检测复杂生物提取物中特定蛋白质存在的常用方法之一。WB必须控制上样量以确保目标蛋白变化具有可比性，通常选择在所有组织中普遍分布的具有相对恒定量的蛋白质作为内参（Loading control）。

为何要选用内参

在Western Blotting中使用内参就是在试验中另外用内参对应的抗体检测内参蛋白。内参就是内部参照，一般是指管家基因编码表达的蛋白，它们在各个组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照。

如何选择内参抗体

1.样本种属来源

 选择内参首先要考虑的就是实验样本来源于什么物种。哺乳动物的组织或者细胞样本，通常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Na+/K+-ATPase, Histone H3 等。植物来源实验样本，则可以选择Plant actin、Rubisco等。其他来源样本研究较少，所以就应该参照文献报导，选择合适的蛋白作为内参。

2.目的蛋白分子量

选择内参抗体时，应该考虑目的蛋白分子量的大小。通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5KD以上。比如检测目的蛋白分子量为45KD，此时不适宜选择β-actin（42KD）作为内参，可以考虑选择GAPDH（36KD）作为内参。

3.目的蛋白表达部位

就一般的蛋白检测来说，β-actin、β-Tubulin抗体等就可以了，而针对于核蛋白的定量，特别是样本蛋白就是核蛋白时，选择恰当的核蛋白内参则更能体现内部参照的价值。常用的核内参抗体有Lamin A、Lamin B、Histone H3，除此之外，其它常见的核蛋白内参还有PCNA、K70、K80等，在一些文献报道中，Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用。而对于膜蛋白检测，常用的内参抗体为Na,K ATPase。对于线粒体蛋白的检测，常用VDAC1和COX IV作为内参抗体。内参的选择需要考虑实际的试验环境，比如某些细胞中，由于组织缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达增高，不适合做内参。比如在在凋亡实验时，Lamin等也不适合作为内参。因此设计实验方案的时候应该考虑这些因素并查询相应文献，在实验过程中也应该注意如果内参表达出现异常，应考虑这方面因素。

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