罗氏实时荧光定量PCR仪（LightCycler®系统）工作原理

实时荧光定量PCR（Quantitative PCR, qPCR）是一种结合PCR扩增和荧光检测的技术，能够对DNA或RNA进行精确定量。罗氏（Roche）的LightCycler®系列仪器（如LightCycler® 480）采用闭管检测方式，通过监测PCR过程中荧光信号的变化，实现核酸的实时定量分析。其核心工作原理可分为以下几个部分：

1. PCR扩增与荧光检测的结合

实时荧光定量PCR在传统PCR的基础上引入荧光标记探针或染料，使扩增过程可以被实时监测。罗氏LightCycler®系统的主要检测方式包括：

(1) 基于荧光探针的检测（如TaqMan探针）

• 探针结构：

• 探针两端分别标记荧光报告基团（如FAM）和淬灭基团（如TAMRA或BHQ）。

• 探针与目标DNA序列互补结合。

• 工作原理：

• 在PCR延伸阶段，Taq DNA酶发挥5'→3'外切酶活性，切割探针，使报告基团与淬灭基团分离。

• 报告基团释放荧光信号，其强度与PCR产物量成正比。

(2) 基于DNA结合染料的检测（如SYBR Green）

• 染料特性：SYBR Green可非特异性地结合双链DNA，并在激发后发出荧光。

• 检测方式：

• 每轮PCR循环后，检测荧光强度，反映双链DNA的累积量。

• 需配合熔解曲线分析（Melting Curve Analysis）验证扩增特异性。

2. 光学检测系统

罗氏LightCycler®仪器采用多通道荧光检测，主要流程如下：

1. 激发光源：LED或卤素灯提供特定波长的激发光（如470nm、530nm等）。

2. 荧光采集：

• 光学传感器在每轮PCR循环后扫描各孔荧光信号。

• 支持多重检测（如FAM、HEX、ROX、Cy5等不同荧光通道）。

3. 信号处理：

• 软件记录荧光强度变化，生成扩增曲线（Amplification Plot）。

3. 定量分析原理

(1) 阈值循环数（Ct值）

• Ct值（Threshold Cycle）：荧光信号达到设定阈值所需的PCR循环数。

• 定量依据：

• 初始模板量越高，Ct值越小；反之，Ct值越大。

• 通过标准曲线法（绝对定量）或ΔΔCt法（相对定量）计算目标核酸浓度。

(2) 标准曲线法（绝对定量）

1. 使用已知浓度的标准品（如质粒DNA）进行梯度稀释并扩增。

2. 绘制Ct值-log(起始拷贝数)标准曲线。

3. 根据待测样本的Ct值，计算其初始模板量。

(3) 熔解曲线分析（特异性验证）

• 适用情况：使用SYBR Green等非特异性染料时。

• 原理：

• PCR结束后，缓慢升温（如60°C→95°C），使双链DNA解链。

• 监测荧光信号随温度的变化，生成熔解曲线。

• 单一峰表示特异性扩增；多峰提示引物二聚体或非特异性产物。

4. 罗氏LightCycler®系统的技术特点

1. 快速温控：

• 采用Peltier半导体技术，升降温速率可达4.8°C/秒，缩短实验时间。

2. 多重检测能力：

• 支持4–6色荧光通道，可同时检测多个靶标（如病原体分型）。

3. 闭管操作：

• 减少开盖污染风险，提高检测稳定性。

5. 应用示例

• 病毒载量检测（如HIV、HBV）：通过Ct值定量病毒RNA/DNA。

• 基因表达分析（qRT-PCR）：比较不同样本中mRNA的相对表达量。

• 突变检测：结合高分辨率熔解曲线（HRM）分析SNP或点突变。

6. 注意事项

• 引物/探针设计：需确保特异性，避免交叉反应。

• 防污染措施：使用UNG酶（尿嘧啶-DNA糖基化酶）降解残留PCR产物。

• 仪器校准：定期进行光学校准和温度验证，保证数据准确性。

总结

罗氏实时荧光定量PCR仪通过荧光标记探针或染料实时监测PCR扩增，结合多通道光学检测和Ct值分析，实现核酸的精确定量。其核心技术优势在于快速温控、多重检测和闭管操作，适用于临床诊断、科研及工业检测等领域。实验成功的关键在于优化反应体系、规范操作流程并定期维护仪器。