一、保存方法選擇與技術(shù)參數(shù)優(yōu)化

1. 短期保存（-80℃）

凍存液配方?

通用型：10% DMSO + 90% FBS，需預(yù)冷至4℃并與細(xì)胞懸液等體積混合

低毒性型：5% DMSO + 2% FBS + 3%海藻糖（適用于敏感細(xì)胞）

程序降溫?

采用梯度冷凍：

4℃ → -20℃（-1℃/min）→ -80℃（過夜）→液氮

使用程序降溫盒可替代梯度操作

2. 長期保存（液氮）

氣相保存?

溫度范圍：-150℃～-190℃，需配備氧濃度監(jiān)測(cè)（＜500ppm）

液相保存?

采用雙層凍存管（耐壓＞500psi），推薦CryoBox™定位系統(tǒng)

二、標(biāo)準(zhǔn)化操作流程

2. 凍存分裝規(guī)范

分裝體積：≤1.5mL/管（耐高壓螺紋管）

標(biāo)記信息：細(xì)胞株編號(hào)+傳代次數(shù)+凍存日期+操作者

3. 復(fù)蘇關(guān)鍵步驟

快速解凍?：37℃水浴震蕩90秒（冰晶完-全消失時(shí)終止）

梯度洗滌?：

首步加入等量預(yù)熱的無血清培養(yǎng)基稀釋

800g離心5分鐘去除DMSO殘留

三、質(zhì)量控制體系

1. 過程監(jiān)控

溫度穩(wěn)定性?：

-80℃冰箱每日溫差≤±2℃，液氮罐周蒸發(fā)量＜0.5L

樣本追溯?：

建立電子檔案（含凍存液批號(hào)/操作人員/設(shè)備編號(hào)）

2. 風(fēng)險(xiǎn)控制

四、特殊細(xì)胞處理策略

1. 懸浮細(xì)胞

預(yù)處理：添加5%羥乙-基淀粉防止細(xì)胞聚集

凍存密度：調(diào)整為1×10?/mL（常規(guī)細(xì)胞的2倍）

2. 原代細(xì)胞

凍存液優(yōu)化：無血清配方（含15%海藻糖+5%人血白蛋白）

分裝方式：預(yù)冷凍存管+快速分裝（操作時(shí)間＜3分鐘）