大體積轉染是貫穿整個細胞和基因治療流程的重要工具，無論是早期研究、臨床前階段還是先進治療藥物（ATMP）的生產(chǎn)。

隨著細胞和基因治療向臨床轉化推進，規(guī)模化能力無疑成為一項要求。此外，記錄工藝中所用原材料是否符合GMP規(guī)范以確?；颊甙踩沧兊迷絹碓街匾?。

無論您仍處于研究階段還是向臨床或商業(yè)化邁進，4D-Nucleofector® LV單元都能幫助您應對這些挑戰(zhàn)。該系統(tǒng)支持封閉式、可擴展的轉染，最高可達10億細胞，并提供用于研究用途和GMP生產(chǎn)的耗材，以及符合21 CFR part 11要求的軟件。

4D-Nucleofector® LV單元在其非病毒、離體細胞和基因治療流程中高效修飾大體積細胞。該技術的應用范圍涵蓋從研究到臨床階段，包括mRNA、CRISPR敲除、堿基或先導編輯等多種方法。

4D-Nucleofector® LV單元與堿基編輯

Chiesa等人（2023）

《堿基編輯的CAR7 T細胞治療復發(fā)性T細胞急性淋巴細胞白血病》

《新英格蘭醫(yī)學雜志》389(10):899-910

階段：I期臨床試驗

疾?。杭毙粤馨图毎籽。ˋLL）

治療：CAR-T細胞（異體）

基因修飾方法：

作者結合堿基編輯（胞苷脫氨）滅活CD52、CD7和TCR β鏈以防止移植物抗宿主病，隨后通過慢病毒整合CD7特異性CAR。堿基編輯步驟中，健康供體外周血單個核細胞（PBMCs）經(jīng)2天激活后，使用4D-Nucleofector® LV單元轉染coBE mRNA（編碼堿基編輯器蛋白：一種催化受損的Cas9切口酶與大鼠來源的單鏈DNA脫氨酶和尿嘧啶糖基化酶融合）及靶向TRBC1和TRBC2的sgRNA。次日，細胞進行CAR插入的轉導，培養(yǎng)10天后冷凍保存。CD52、CD7和TCR的敲除效率為92%至99%。

在I期試驗中，3名復發(fā)性ALL兒童接受了這種異體CAR-T細胞治療的安全性評估。研究驗證了堿基編輯作為治療方法的可行性，但也指出了免疫治療中可能出現(xiàn)的并發(fā)癥。

Woodruff等人（2023）

《大規(guī)模生產(chǎn)堿基編輯的嵌合抗原受體T細胞》

《分子治療方法與臨床發(fā)展》31:101123

階段：臨床前

疾病：N/A

治療：CAR-T細胞（異體）

基因修飾方法：

研究人員通過堿基編輯敲除健康供體T細胞中的PD-1，隨后用慢病毒轉導抗CD19 CAR。在堿基編輯中，他們比較了線性mRNA與環(huán)狀mRNA的效果。小規(guī)模驗證后，將應用擴展至大規(guī)模生產(chǎn)臨床劑量的1×108 CAR-T細胞。簡言之，經(jīng)2天激活的PBMCs或CD4+/CD8? T細胞以5×10? mL的濃度轉染不同量的BE4max環(huán)狀RNA和靶向PD-1的sgRNA。轉染后一天，細胞進行抗CD19 CAR轉導，再培養(yǎng)9天。根據(jù)環(huán)狀mRNA用量，堿基轉換效率為86%至接近轉換。

作者證明，在臨床規(guī)模下使用環(huán)狀mRNA能以8倍更少的RNA實現(xiàn)更高的編輯效率，從而顯著降低成本。

Georgiadis等人（2021）
《堿基編輯的CAR T細胞用于T細胞惡性腫瘤的聯(lián)合治療》
《白血病》35(12):3466-3481

階段：臨床前
疾?。篢細胞急性淋巴細胞白血?。═-ALL）
治療：CAR-T細胞（異體）

基因修飾方：
倫敦大學學院的研究團隊通過堿基編輯（或CRISPR NHEJ）敲除TCR/CD3和CD7，隨后慢病毒引入CAR。敲除CD3和CD7旨在避免治療T細胞惡性腫瘤時的“自相殘殺”。簡言之，從健康供體分離PBMCs并激活，隨后用靶向TCR恒定β鏈（TRBC）和CD7的sgRNA及SpCas9 mRNA或coBE3 dCas9 mRNA通過4D-Nucleofector® LV單元轉染。24小時后，細胞用慢病毒載體轉導，表達靶向CD3（3CAR）和CD7（7CAR）的CAR。結果顯示，CAR表達穩(wěn)健，TCRαβ/CD3和CD7的表面表達單敲除效率為50%至>95%，雙敲除為37%至60%。3CAR和7CAR共培養(yǎng)可實現(xiàn)“自我富集”，獲得99.6% TCR–/CD3–/CD7–細胞群體。這些細胞表現(xiàn)出特異性細胞毒性，無脫靶活性或堿基轉換問題。3CAR和7CAR T細胞還在人源化小鼠異種移植模型中評估了抗白血病效力。

4D-Nucleofector® LV單元與CRISPR敲除

Ottoviano等人（2022）
《CRISPR工程化CAR19通用T細胞治療難治性B細胞白血病兒童的I期臨床試驗》
《科學轉化醫(yī)學》14, eabq3010

階段：I期臨床試驗
疾?。築細胞急性淋巴細胞白血病（B-ALL）
治療：CAR-T細胞（異體）

基因修飾方法：
作者結合慢病毒引入靶向CD19的CAR和CRISPR gRNA（靶向TRAC和CD52），并通過非病毒方式傳遞Cas9 mRNA。簡言之，健康供體的PBMCs激活1天后，用慢病毒載體轉導編碼抗CD19 CAR基因及靶向TRAC和CD52的sgRNA以實現(xiàn)多重編輯。3天后，細胞通過4D-Nucleofector® LV單元轉染Cas9 mRNA。轉染后，細胞進一步擴增，7天后通過磁珠去除殘留的TCRαβ表達T細胞。該方法實現(xiàn)了86%至98%的CAR19表達，殘留TCR表達為0.1%至1%。

在I期臨床試驗中，6名難治/復發(fā)性CD19陽性B-ALL兒童接受了治療。研究證明了CRISPR免疫療法的可行性、安全性和治療潛力，其中2名兒童病情緩解。

Vazquez-Lombardi等人（2022）
《通過功能篩選的高通量T細胞受體工程鑒定出效力和特異性增強的候選分子》
《免疫》55:1953–1966

階段：研究
疾?。篘/A
治療：TCR

基因修飾方法：
本研究旨在開發(fā)一種識別高效力和高特異性工程化T細胞受體（TCR）的方法。建立的“TCR引擎”高通量方法結合了CRISPR基因組編輯、計算TCR設計和深度測序。簡言之，通過CRISPR-Cas使用小規(guī)模4D-Nucleofector® X單元修飾Jurkat細胞，生成TCR受體細胞。通過五步連續(xù)整合Cas9、人CD8、NFAT-GFP和mRuby（通過HDR），并刪除內源性CD4、TCRα和Fas（通過NHEJ）。每一步后，通過流式分選細胞并測序驗證。隨后設計靶向MAGE-A3（TCR-A3）的>30種突變TCR變體的組合HDR模板庫，與靶向內源性TCRβ的gRNA一起通過4D-Nucleofector® LV單元轉染1億細胞。通過綜合篩選程序鑒定出目標識別增強的TCR變體，并在原代T細胞中進一步驗證其安全性和效力。

Lattanzi等人（2021）
《人類造血干細胞中β-珠蛋白基因校正的開發(fā)作為鐮狀細胞病的潛在持久治療》
《科學轉化醫(yī)學》13(598):eabf2444

階段：臨床前（支持IND的研究）
疾病：鐮狀細胞?。⊿CD）
治療：基因校正

基因修飾方法：
研究人員結合非病毒電穿孔遞送CRISPR RNP和重組腺相關病毒遞送HDR模板，校正導致SCD的β-珠蛋白（HBB）基因點突變。臨床規(guī)模下，60%的HBB等位基因得到校正。移植至NSG小鼠后觀察到20%的基因校正，且未發(fā)現(xiàn)基因毒性或致瘤性。

4D-Nucleofector® LV與病毒生產(chǎn)

Nawandar等人（2022）
《通過合成基因組重組表達生產(chǎn)的人細小病毒》（bioRxiv預印本）

階段：研究
疾病：N/A

基因修飾方法：

細小病毒（Anelloviruses）在人類中普遍存在，但免疫原性較低且不致病。因此，基于這些病毒開發(fā)基因療法可能成為其他常用病毒的有力替代方案，并允許重復給藥。目前，由于缺乏體外生產(chǎn)該病毒的系統(tǒng)，其生物學特性尚未得到廣泛研究。

本研究通過轉染T細胞來源的MOLT-4細胞系，成功實現(xiàn)了兩種β扭轉病毒（Betatorquevirus，細小病毒屬之一）的重組生產(chǎn)。實驗中使用的質粒編碼該病毒屬的LY2基因組或nrVL4619基因組。簡而言之，小規(guī)模試驗（轉染1000萬細胞）后，進一步擴大生產(chǎn)規(guī)模：使用4D-Nucleofector® LV Unit系統(tǒng)，在20 mL連續(xù)流工藝中轉染20億細胞（質粒用量2 mg）。分析內容包括病毒基因表達、復制、電子顯微鏡成像以及組織特異性體內感染實驗。該工作為這一潛力病毒家族的后續(xù)研究奠定了基礎。

大體積轉染模塊: 4D-Nucleofectorm LV 模塊優(yōu)勢

-封閉的系統(tǒng)-核轉染細胞數(shù)量多達109個規(guī)?？烧嬲糯?/p>

-以少量樣品建立方法成熟的轉染方案

-超過700多個優(yōu)化細胞類型操作簡單-極少的培訓需求

-4D-Nucleofector LogWare-可使用符合21CFR part 11的軟件進行操作

-TheraPEAK Nucleofector耗材-加快滿足GMP過程要求的進度