蛋白定量的方法有很多種，應(yīng)用較多的主要有兩種：BCA蛋白定量檢測法和Bradford蛋白定量檢測法，市售的蛋白定量試劑盒也多基于上述兩種檢測方法而開發(fā)的。兩種方法均需配制蛋白標準品，蛋白與定量試劑經(jīng)過一定時間的反應(yīng)（BCA法反應(yīng)為37℃、20-30min，Bradford法反應(yīng)一般為37℃，5min），酶標儀讀取樣品的OD值，繪制的蛋白標準曲線，依據(jù)標準曲線計算WB蛋白的濃度。

蛋白定量:

取適量上述步驟中未變性的總蛋白溶液，用 BCA 蛋白定量檢測試劑盒（G2026-200T；G2026-1000T）測蛋白濃度，蛋白濃度測定方法如下：

A.配制蛋白標準貯備液

取1 mL蛋白標準配制液加入到蛋白標準品（BSA）蛋白標準管中，將25 mg蛋白標準品全溶解，即得到濃度為25 mg/mL的蛋白標準貯備液。配制成的蛋白標準溶液可-20℃長期保存。

B.配制蛋白標準工作液

取適量25 mg/mL蛋白標準貯備液，用PBS或生理鹽水稀釋50倍，得到終濃度為0.5 mg/mL的蛋白標準工作液。注意稀釋時按照10倍梯度方法稀釋，確保稀釋準確。

C.繪制標準曲線（酶標儀法）

將蛋白標準工作液分別按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板中，然后用PBS或生理鹽水依次加20、19、18、16、12、8、4、0 μL將上述梯度工作液補足到20 μL。得到蛋白濃度依次為0、25、50、100、200、300、400、500 μg/mL的梯度曲線。

D.準備待測樣品

將待測的蛋白樣品進行適當(dāng)稀釋（可通過預(yù)實驗檢測，使樣品蛋白濃度在標準曲線范圍內(nèi)，確保檢測結(jié)果可信），按照每個樣品20 μL的量加到96孔板中。待測樣品與蛋白標準品用相同溶液稀釋。

E.配制BCA顯色工作液

將BCA試劑與硫酸銅溶液按照50:1體積比充分混合均勻，得到BCA顯色工作液。BCA顯色工作液可室溫保存，24 h內(nèi)使用。每個待測樣品需200 μL，建議按需配制，避免浪費。

F.檢測

向標準曲線樣品孔及待測樣品孔中每孔加入BCA顯色工作液200 μL，充分混勻（可將96孔板放在振蕩器上振蕩30 s），37℃反應(yīng)30 min后，以標準曲線0號做參比，在562 nm波長下比色測定，記錄各孔吸光度值。（注：也可以在室溫反應(yīng)2 h，或60℃反應(yīng)30 min。如果蛋白濃度較低，建議置于60℃反應(yīng)） 

G.計算

以標準曲線中梯度蛋白含量（μg/mL）為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪出標準曲線。根據(jù)所測樣品的吸光值，在標準曲線上即可查得相應(yīng)孔中待測樣品的蛋白濃度（μg/mL），再乘以樣品稀釋倍數(shù)即為待測樣品實際蛋白濃度。

提示：

1. BCA法測定蛋白濃度受溫度和時間的影響較大，吸光度值會隨著時間的延長或溫度升高而變化，如果不能精確控制顯色反應(yīng)的時間和溫度，建議每次測定都需要做標準曲線。

2. 在進行蛋白標準貯備液的配制時，需確保溶解充分。稀釋配制蛋白標準工作液時建議10倍梯度稀釋，不要一次稀釋50倍，以免產(chǎn)生較大誤差。

3. 為保證蛋白的精確定量，樣品的提取和蛋白標準品的稀釋配制最好選用相同的緩沖液，同保證兩者檢測條件一致。如果緩沖液本身就有較高的背景值，建議使用其他的方法測定。

4. 操作時請穿實驗服，并佩戴一次性手套。