研究背景：

抗衰老药物开发的一个主要挑战是有效靶点的确定。表观遗传失调已成为衰老的关键标志和驱动力，这表明改善这种失调可能是缓解衰老表型的一种有希望的策略。据报道，补充代谢物，包括NAD+前体，α-酮戊二酸盐等，在一定程度上通过表观遗传调控表现出恢复青春的作用。然而，小分子化合物在代谢过程中靶向酶是否能够通过代谢-表观遗传调控来缓解衰老表型，这在很大程度上仍然未知。

前期研究发现氯磺丙脲（chlorproamide, Chl）是磺脲类化合物，通过线粒体相关途径对秀丽隐杆线虫发挥抗衰老作用，然而Chl和磺酰脲类化合物的抗衰老作用靶点尚不清楚。

研究结果：

1、MDH2调节细胞衰老

使用基于先前报道的靶向线粒体的抗衰老化合物（Chl）设计的化学探针（Chl- p），进行了基于活性的蛋白质谱分析（ABPP，由百泰派克提供），以发现磺脲类药物的潜在抗衰老靶点（图1a）。在通过原位Chl- p标记和人胚胎肺成纤维细胞（MRC-5细胞）中10倍Chl竞争检测到的蛋白质中，MDH2成为一个潜在的靶标（图1a），因为它在线粒体代谢中的功能与之前报道的磺脲类药物的抗衰老机制有关。

用免疫印迹法测定了阿霉素（Dox）诱导衰老的 MRC-5细胞（图1b，c）和复制衰老的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）（图 1d，e）中 MDH2 的水平。结果显示 MDH2 水平与细胞衰老呈正相关（图1b-e）。MDH2敲除和过表达实验结果证实，MDH2 可调控体外培养成纤维细胞的衰老过程。

图1 MDH2调节细胞衰老

2、Gli抑制MDH2，延缓细胞衰老和小鼠衰老

为了测试磺酰脲类药物对MDH2的影响，评估了重组MDH2在不同磺酰脲类药物（包括Chl、Glibenclamide（Gli）、tolbutamine （Tolb）、gliclaide （Glic）和gllipizide (Glip)）处理下的活性。其中Gli对MDH2的抑制率最高，而Chl仅表现出微弱的抑制作用。为了验证Gli和MDH2之间的相互作用，合成了一种化学探针（Gli- p）（图2a）。在MRC-5细胞中，Gli- p对MDH2的原位标记被8倍Gli显著竞争（图2b），表明Gli和MDH2之间存在直接相互作用。测定Gli与MDH2的结合常数（KD）为23.9 μM（图2c），证实了Gli与MDH2的相互作用。Gli对衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色的缓解效果优于Chl（图2d，e）。

其他细胞实验结果表明Gli延缓了Dox诱导的细胞衰老和复制性衰老，减轻了细胞衰老过程中DNA损伤的积累。小鼠模型结果也证实了Gli作为MDH2抑制剂在体内具有抗衰老作用。

图2 Gli在体内和体外均可缓解衰老表型

3、Gli缓解依赖于MDH2的细胞衰老

为了确定Gli缓解细胞衰老的作用是否依赖于MDH2，创建了MDH2敲低和过表达细胞模型，并测试Gli对衰老标志物的影响。结果显示，在敲低的细胞中，抵消了Chl和Gli的影响，而Gli比Chl更能减轻SA-β-gal染色。过表达的细胞中，发现Gli降低p16INK4a表达（图3f，g）和SA-β-gal阳性（图3h，i）的程度与阴性对照相同。这些结果表明Gli以MDH2依赖的方式延缓细胞衰老。

图3 Gli缓解依赖于MDH2的细胞衰老

4、Gli通过抑制MDH2调节中枢碳代谢

之前的研究表明，Chl诱导复合体II衍生的线粒体活性氧（mtROS）。在Gli处理的细胞中，MitoSOXTM的荧光增加（图4a），这与之前的报道一致。为了进一步研究Gli或sh-MDH2对能量代谢的影响，检测了亚细胞乳酸水平。发现细胞质和细胞核中的乳酸水平升高（图 4b），这表明 MDH2 抑制剂会导致TCA循环抑制，从而诱导有氧糖酵解。

在使用或不使用Gli处理的细胞（2 h）中进行靶向代谢检测，结果显示，不同组间的代谢物主要涉及 “癌症中枢碳代谢 ”和 “蛋白质消化吸收 ”过程（图 4c）。糖酵解中间产物被下调（图 4d），而TCA循环中间产物（图4e）和构成生物体蛋白质的全部20种氨基酸（图4f）被上调。处理24 h后，只有TCA 循环癌症中的中心碳代谢中的代谢物富集（图 4g）。糖酵解中间产物（图 4h）和 18 种氨基酸（图 4j）的水平得到恢复，而 TCA 循环中间产物的水平仍然上调（图 4i）。这些结果证实了 Gli 直接靶向TCA循环并保持其代谢改变，而其他代谢途径的改变在长期使用 Gli 治疗中可以得到补偿。

为了证实Gli通过抑制MDH2调控中心碳代谢，测定了Gli处理2小时后sh-Scr和sh-MDH2细胞中不同代谢物的含量。结果显示，在Gli处理和sh-MDH2细胞中，MDH2催化的从苹果酸到草酰乙酸的转化被阻断。Gli还下调了sh-Scr细胞中的氨基酸水平，而 sh-MDH2的作用被抵消了。这些结果表明，Gli 以依赖 MDH2 的方式调节碳代谢中心的代谢物。

图4 Gli以TCA循环为目标，调节中枢碳代谢

5、MDH2抑制调节SAH代谢和组蛋白甲基化

在依赖于MDH2的26种Gli调控的差异代谢物中（图5d，橙色字体），补充S-腺苷高半胱氨酸（SAH）zuì xiǎn zhù地降低了p16INK4a的表达（图 5e）。Gli处理后，细胞内SAH水平下降，而S-腺苷甲硫氨酸（SAM）水平上升（图5f）。这些结果表明，MDH2 抑制增强了蛋氨酸循环通量，该通量将SAH水解为高半胱氨酸，并以蛋氨酸为底物合成SAM（图 5g）。在组蛋白甲基化位点中，Gli 在1天的处理中上调了H3K27me3水平，而H3K4me3和 H3K9me3水平未受影响（图 5h，i）。在5天的处理中，H3K4和H3K27的三甲基化都增加了（图 5j，k）。由于组蛋白甲基化对蛋氨酸代谢的动态很敏感，这些表型支持了在 MDH2 抑制下蛋氨酸循环通量的激活。

其他衰老细胞结果显示，Gli上调了NRK-52E细胞中H3K4me3和H3K27me3的水平，而SAH只诱导了H3K4的三甲基化，这表明在MDH2抑制下，H3K27me3是甲基化的关键位点，可以延缓细胞衰老。

图5 DA增加了UUO肾脏中p-β-catenin (S33/37/45/T41)，降低了总β-catenin含量

6、体内抑制MDH2延缓肝脏衰老，上调H3K27me3

通过肝脏特异性敲低MDH2和Gli处理，检测相关标志物和组蛋白修饰。结果显示，敲低MDH2或Gli处理均能显著降低衰老小鼠肝脏中p16INK4a的表达水平，并上调H3K27me3水平。研究结果表明MDH2抑制（通过Gli或sh-Mdh2）干扰TCA循环，增强蛋氨酸循环通量，诱导H3K27me3的甲基化修饰，从而通过代谢-表观遗传调控减轻细胞衰老和组织衰老（图7）。

图6 抑制 MDH2 可延缓肝脏衰老并提高体内 H3K27me3 水平

图7 抑制 MDH2 的代谢表观遗传调控抗衰老作用示意图

研究结论：

研究介绍了一种通过靶向MDH2来缓解衰老表型的新方法，从而增强蛋氨酸循环通量并逆转组蛋白甲基化的年龄相关改变。Gli作为MDH2的小分子抑制剂，是一种很有前景的先导化合物，可以通过修饰获得最佳的MDH2抑制活性和药代动力学性质。基于Gli的衍生物可以更好地靶向MDH2，在通过代谢干预延缓衰老和减轻年龄相关疾病方面具有很大的治疗潜力。

参考文献：Mao, Z., Liu, W., Zou, R. et al. Glibenclamide targets MDH2 to relieve aging phenotypes through metabolism-regulated epigenetic modification. Sig Transduct Target Ther 10, 67 (2025).

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