流式细胞实验中如何选择合适的抗体？

在流式细胞实验过程中，荧光抗体会直接影响着实验的数据质量，来聊聊抗体选择的小技巧：

1）确定抗体基本信息

确定检测的指标，目的细胞的特异性表面标记或胞内标记；

根据检测样本种属选择可适用抗体；

根据抗体说明书，明确可用于流式实验。

2）确定仪器的参数配置

激光器：不同流式细胞仪激光器不同，常见的有405nm，488nm和635nm。

滤光片：检测通道数量决定可以同时检测的指标数，所选择荧光素要在仪器的可检测范围内。

仪器：相同荧光在不同仪器上检测通道可能不同，需要参照仪器说明。

3）荧光素的选择

抗原表达弱或分群不明显的建议选择强荧光，如PE、APC。

抗原表达强或分群明显的建议选择*常用的弱荧光例如FITC。

常用荧光强弱排序为：PE>APC>PE-cy5Cy5>PercCPp-Cycy5.5>FITC

4）多色荧光搭配

同时检测几个指标时，需要多荧光标记进行搭配。

注意所使用的仪器有哪些激光，各通道之间的荧光素可以随意搭配，检测通道不能冲突。

如需要做多个指标，而流式细胞仪能检测的通道不够，可将指标归成2类，再将样本分成2份，分别进行检测。

所选荧光素光谱的重叠应当尽量减少，否则将会导致较大的补偿。

5）同型对照抗体的选择

同型对照，是用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色，类似于阴性对照，是流式细胞实验*可*缺的一项。

同型对照是与一抗相同种属来源、相同亚型及亚链、相同荧光标记的免疫球蛋白，也要求使用相同剂量。

如果同型对照的表达会比抗体的表达高，首先检查同型对照的抗体是否加错类型、剂量等。其次，因为有些标志在细胞的表面或者胞内表达不高，而跟其类似的抗原非常多，那么同型对照非特异性的结合会超过抗体的特异性，所以会造成这种现象。这个时候推荐使用其他阴性对照，如空白对照等。

6）直接法与间接法染色的选择

直接法：即使用直接偶联抗体，可直接多重分析来自同一宿主的抗体。实验步骤更快，并且能够在一项检测中使用许多不同的抗体，从而能够同时读取大量终点。

间接法：即使用非偶联一抗 + 偶联二抗，可改善以低丰度存在的靶标的检测，由于二次放大可提供更高的灵敏度。