1.前言

在分子克隆实验中，感受态细胞转化是基因克隆的基础步骤之一。但相信很多同学在涂板后，常?；岢鱿制桨迳暇湎∩偕踔痢翱湛杖缫病钡霓限尉置?，这不仅耽误我们的实验进度，还会消耗宝贵的试剂和时间。实验为何会卡在这一步？本篇文章，将从几个关键环节入手，一起和大家好好探讨一下这个问题。

2.感受态细胞“不给力”

感受态细胞的转化效率直接决定了实验成败。如果细胞本身质量不佳，后续操作再完好也无济于事。例如感受态细胞经常反复冻融或长期储存（超过6个月），则很有可能会导致其活性显著下降。

感受态细胞是非常脆弱的，一些操作上的失误同样会严重影响转化效率，冻融过程中如果未将细胞置于冰上，则可能会破坏细胞膜的脆弱结构；解冻后若未及时使用（如放置超过10分钟），细胞活性会快速下降；加入质粒后剧烈吹打也会破坏细胞膜，进一步降低转化成功率。正确的操作应该是：冻融时需全程冰上操作，解冻后立即进行转化反应，质粒加入后仅需轻弹混匀。

3 质?！坝昧俊辈坏被蛴胨拗骶患嫒?/p>

质粒是转化成功的核心，但它的用量常被忽视。在感受态细胞转化实验中，质粒的用量需通过质量（ng） 而非体积（μL）去控制。

若仅依赖体积添加，就可能会因为质粒浓度差异导致实际用量超出合理范围（通常建议是 50-100 ng），进而影响转化效率。我们可以利用分光光度计测量质粒浓度，再依照公式：体积（μL）= 目标质量（ng） / 质粒浓度（ng/μL），计算出所需添加的体积。

某些质粒需要特定宿主菌才能正常复制或表达。例如pET系列质粒需使用BL21(DE3)菌株表达蛋白，因为该菌株通过λ噬菌体DE3溶源整合，染色体携带T7 RNA聚合酶基因，可驱动pET质粒的T7启动子转录目标基因。若质粒与宿主菌的复制起点不兼容不匹配，则可能导致质粒无法复制，转化后无菌落。

4 热激条件不“精准”

热激是感受态细胞吸收质粒的关键步骤，其温度、时间和操作顺序需严格控制。若条件不精准，可能导致质粒无法有效进入细胞或细胞膜修复过快，影响转化效率。热激时间过短，会导致无法充分打开细胞膜孔道；而热激时间过长则可能损伤细胞。

热激完后，我们还需要将细胞放在冰上冰浴一段时间，这一步的目的是修复细胞膜裂隙，避免细胞因膜结构破损而死亡。如果少了这一步，就可能导致细胞膜无法闭合，转化效率下降或细胞死亡。

5 抗生素“过量”或“失效”

抗生素是筛选成功转化的抗性菌落的关键，但如果抗生素失效或浓度过高会直接导致转化菌筛选失败。储存不当或过期的抗生素会失去抑菌活性，而浓度过高则会抑制目标菌生长。操作失误，如使用添加错误类型抗性平板，也会导致实验失败。

6 涂板操作不“细致”

涂板是转化的最后一步，一些操作上的细节疏漏也可能导致前功尽弃。涂布量过多或过少会影响菌落密度与生长效率，建议控制涂布量在10-50 μL。菌液未充分混匀或涂布器未覆盖整个平板表面，导致局部菌落过密或空白。而如果使用涂布棒用力摩擦琼脂表面，损伤细胞或菌液堆积。

正确的操作应该是：加入菌液后，使用无菌涂布棒轻柔旋转，充分分散菌液；涂布后需静置5分钟，待菌液被平板全部吸收后再倒置培养，防止冷凝水滴落污染菌落。

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