一、3D肿瘤球体的培养流程 

1. 培养系统的选择

- 旋转式生物反应器（RWV） 

  - 通过持续旋转（速度通常为15-30 rpm）使细胞处于自由悬浮状态，减少剪切力损伤，促进细胞自聚集形成球体。 

  - 优势：适用于大规模培养，能生成均一性较好的球体。 

  - 案例：NASA的旋转壁容器常用于培养乳腺癌、胶质瘤等肿瘤球体。 

- 悬滴法（Hanging Drop） 

l  将细胞悬液滴加在培养板盖背面，利用重力作用使细胞在液滴底部聚集形成球体。 

l  优势：操作简单，适合高通量药物筛选。 

l  局限：球体尺寸较?。ㄍǔ?span><500 μm），难以长期维持。 

- 磁悬浮3D培养（如BioLevitator） 

l  利用纳米磁性颗粒标记细胞，通过磁场抵消重力，形成无支架3D球体。 

l  优势：快速成球（24-48小时），可精准控制球体大小。 

- 基质胶（Matrigel）或水凝胶支持法

l  将肿瘤细胞嵌入富含ECM成分的基质胶中，模拟体内基质支撑。 

l  优势：保留细胞-基质相互作用，适用于侵袭性研究。 

2. 关键步骤与技术参数

1.细胞选择与预处理 

l  使用患者来源的原代肿瘤细胞（PDCs）或肿瘤细胞系（如MCF-7、U87-MG）。 

l  添加肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）、免疫细胞（如T细胞、巨噬细胞）共培养，模拟TME的异质性。 

2. 培养条件优化 

l  细胞密度：通常为5×103~1×10? cells/mL（过高易形成坏死核心）。 

l  培养基：添加生长因子（如EGF、bFGF）、低血清（2-5% FBS）以抑制单层贴壁生长。 

l  氧浓度：通过低氧培养箱（1-5% O?）模拟肿瘤内部缺氧环境，激活HIF-1α通路。 

3. 动态监测与质量控制 

l  球体尺寸：通过显微镜或自动成像系统监测（目标直径：200-1000 μm）。 

l  活性检测：Calcein-AM（活细胞绿色荧光）/碘化丙啶（PI，死细胞红色荧光）双染色。 

l  代谢分析：检测乳酸分泌、葡萄糖消耗评估代谢重编程（Warburg效应）。 

二、模拟肿瘤微环境的关键策略

1. 细胞异质性共培养

l  肿瘤细胞 + 基质细胞：共培养CAFs、内皮细胞（模拟血管生成）或间充质干细胞（MSCs）。 

l  免疫细胞浸润模型：加入T细胞、巨噬细胞（如THP-1来源的M2型），研究免疫逃逸机制。 

2. 细胞外基质（ECM）的调控** 

l  基质成分：添加胶原蛋白（Ⅰ/Ⅳ型）、纤连蛋白、透明质酸，模拟肿瘤ECM的刚性（5-20 kPa）。 

l  动态ECM重塑：利用酶（如MMP-2/9）或机械刺激模拟肿瘤侵袭过程中的基质降解。 

3. 梯度氧与营养供应 

l  -氧梯度：通过微流控芯片（Organ-on-a-chip）在球体中建立氧浓度梯度，模拟核心缺氧与边缘富氧区域。 

l  -药物渗透测试：将阿霉素等化疗药加入系统，观察球体内部药物分布差异（与外层相比，核心药物浓度可能降低10倍以上）。 

三、3D肿瘤球体的应用场景 

1. 肿瘤生物学研究 

l  侵袭与转移：通过Transwell实验或活细胞成像，观察球体细胞向周围基质的迁移能力。 

l  耐药性机制：比较2D与3D培养中肿瘤细胞对顺铂、紫杉醇的IC50差异（3D模型通常耐药性高10-100倍）。 

2. 个性化药物筛选

l  患者来源肿瘤球体（PDOs）：将手术样本直接培养为球体，测试个体化化疗方案（敏感性预测准确率>80%）。 

l  免疫治疗评估：将PD-1/PD-L1抑制剂与肿瘤球体+免疫细胞共培养，检测T细胞杀伤效率。 

3. 肿瘤-微环境互作研究

l  血管生成实验：在球体中嵌入内皮细胞，观察微血管网络的形成（VEGF抑制剂可显著抑制此过程）。 

l  代谢交互作用：通过代谢组学分析肿瘤细胞与CAFs之间的乳酸-谷氨酰胺交换。 

四、技术挑战与优化方向 

1. 标准化问题 

l  不同实验室的球体尺寸、细胞比例差异较大，需建立统一评价标准（如MINAST准则）。 

2. 血管化与长期培养

l  现有球体内部易坏死（>500 μm时），需结合生物打印技术构建血管化通道。 

3. 高内涵分析技术 

l  开发AI驱动的图像分析算法，自动量化球体形态、细胞分布及药物响应。