实时荧光定量PCR（Real-time qPCR）是指在PCR反应中加入荧光基团，通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化，即时分析目的基因的初始量的一种PCR技术。

一、荧光化学物质

Real-time qPCR所使用荧光化学物质有荧光染料和荧光探针两类。

1、荧光染料

目前主要使用的荧光染料是SYBR Green I，SYBR Green I是一种嵌入型花箐染料，在488nm（蓝光）照射激发后，在522nm（绿光）具有发射高峰。

SYBR Green I是嵌在DNA螺旋的小沟里面的，一般用来染双链DNA，在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。

2、荧光探针

Real-time qPCR中常用的荧光探针为TaqMan探针，其基本原理是依据目的基因设计合成一个能够与之特异性杂交的FRET探针，该探针的5'端标记荧光基团，3'端标记淬灭基团。正常情况下两个基团的空间距离很近，荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收而不能发出荧光；PCR扩增时，引物与该探针同时结合到模板上，探针的结合位置位于上下游引物之间；当扩增延伸到探针结合的位置时，PCR酶利用5'→3'外切酶活性将探针酶切降解，使荧光基团和淬灭基团分离，从而使其发出荧光。

荧光信号被荧光监测系统接收，检测到的荧光分子数与PCR产物的数量成正比，因此，根据PCR反应体系中的荧光强度即可计算出初始DNA模板的数量。

1）荧光共振能量转移FRET

荧光共振能量转移是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（供体 Donor）的发射光谱与另一个基团（受体 Acceptor）的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离临近至一定范围时（一般小于100?／10nm），就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即以前一种荧光基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光。

简单地说，就是在供体基团吸收一定频率的光子后第一电子发生能级跃迁被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移的过程。

此过程没有光子的参与，所以是非辐射的，供体分子被激发后，当受体分子与供体分子相距一定距离，且供体和受体的基态及第一电子激发态两者的振动能级间的能量差相互适应时（同一振荡频率），处于激发态的供体将把一部分或全部能量转移给受体，使受体被激发，在整个能量转移过程中，不涉及光子的发射和重新吸收。如果受体荧光量子产率为零，则发生能量转移荧光熄灭；如果受体也是一种荧光发射体，则呈现出受体的荧光，并造成次级荧光光谱的红移。

①FRET发生条件：

a.供体分子的发射光谱应与受体分子的激发光谱必须有显著重叠（＞30%）。

b.供体分子与受体分子的作用距离必须在1-10nm之间，基团间的FRET效率可由E=1/［1+(R/R0)?］反映（R表示基团分子之间的距离；R0表示E=50%时供体和受体分子间的距离，依赖荧光基团发射谱和淬灭基团激发谱的重叠程度以及基团能量转移的偶极子的相对方位，对于特定的供体受体对是常数）。

FRET程度与基团之间的空间距离紧密相关，随着距离延长，FRET呈显著减弱。

c.供体分子的发射态偶极矩与受体分子的吸收态偶极矩、以及它们的向量必须满足一定的条件。

b.检测分子的折叠与构像变化：

2）TaqMan探针

①设计原则：

a.长度：建议15-30bp，以保证结合特异性；扩增子长度应小于150 bp。

二、定量原理

理想的PCR反应：X＝X?*2?；实际的PCR反应：X＝X?*(1＋Ex)?（n：扩增反应的循环次数，X：第n次循环后的产物量，X?：初始模板量，Ex：扩增效率）；在扩增产物达到阈值线时：XCt＝X?*(1＋Ex)??＝S （XCt：荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量，在阈值线设定以后，它是一个常数，设为S）；方程式两边同时取对数得: lgS＝lg［X?*(1＋Ex)??］，整理方程式得: lgX?＝-lg(1＋Ex) ??＋lgS。

结论：

①模板DNA量越多，达到荧光阈值的循环数越少，即Ct值越小。

②lg浓度与循环数呈线性关系。

a. 根据样品扩增达到阈值的循环数（Ct值）即可计算出样品中所含的模板量。(相对定量)

b. 通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，即可计算出样品中所含的模板量。（绝对定量）

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