了解RNA提取技术的前世今生，轻松搞定血液RNA样本！

RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。RNA的提取是分子生物学研究的基础，在进行cDNA文库构建、体外反转录、实时荧光定量PCR、Northern杂交分析等下游分子生物学实验时都需要高质量、高纯度及完整性好的RNA。然而RNA很是“娇弱”，一不小心就会提取失败。究其原因主要是RNase的内外源性污染。RNase是一种相对稳定遍布我们生活的一种核酸内切酶，比如我们的双手、实验仪器、周围环境，甚至样品本身都有RNase的存在，它能催化RNA高效降解，因此能否有效防止RNase的污染，是提取高质量RNA的关键。

1. RNA简介

RNA是核糖核酸，其简称来自于RiboNucleicAcid，是存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA是由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成的长链状分子。与DNA不同，RNA一般为单链长分子，以DNA的一条链为模板，以碱基互补配对原则，转录而形成的一条单链，主要功能是实现遗传信息在蛋白质上的表达，是遗传信息向表型转化过程中的桥梁。有些生物，例如一些病毒，也直接使用RNA作为遗传信息的载体，如（SARS-CoV-2）。

2. RNA提取基本原理及原则

不同组织总RNA提取实质就是将细胞裂解，释放出RNA，并通过不同方式去除多糖、酚类、蛋白以及DNA等杂质，通过一系列的抽提、洗涤和沉淀，最终获得高纯RNA产物的过程。而RNA提取原则主要有4点：1. 保证RNA销售结构的完整性；2. 提取的RNA样品中不应存在对酶存在抑制作用的有机溶剂及过高浓度的金属离子；3. 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到程度；4. 排除其它核酸分子（DNA）的污染。

3. RNA 提取技术的发展历程

随着RNA的深入研究和广泛应用，RNA提取纯化技术也得到了很大的发展，从广泛使用地传统手工法RNA提取发展为通过核酸提取仪来自动化提取RNA。

（1）传统手工法RNA提取技术

早期的RNA提取技术

早期的RNA提取技术是异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，其原理是使用蛋白质变性剂异硫氰酸胍有效抑制RNA酶的活性，经过氯化铯介质进行密度梯度超速离心，使RNA沉淀于管底，但这种提取方法操作复杂、流程长，一次提取的样品数量有限并且对实验设备要求高。后来为解决没有超速离心等科研设备问题，科学家们提出了盐酸胍-有机溶剂法，利用胍盐抑制RNA酶，匀浆裂解细胞，有机溶剂抽提去除蛋白质，通过选择性沉淀RNA分子而去除DNA，这种方法虽然解决了没有超速离心机的问题，但整个操作过程繁杂费时。

Trizol法RNA提取技术

随着科学技术的发展，又出现了很多手工提取纯化RNA的技术，其中的是Trizol法。Trizol试剂的主要成分是苯酚和异硫氰酸胍。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能抑制RNA酶活性。异硫氰酸胍是强有力的蛋白质变性剂，既能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离，又对RNA酶有强烈的变性作用。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。Trizol试剂不但可用于小量样品，也可用于大量样品，对动物、植物、细菌、血液提取都适用，可同时处理大量不同样品。

柱提法和磁珠法RNA提取技术

Trizol法虽然被广泛使用，得到的RNA的质量也较好，但是Trizol试剂本身对身体有害。因此手工提取RNA法又陆续涌现了新的技术，如硅胶柱提法和手工磁珠法，其中柱提法试剂盒采用的裂解系统，无需有毒的酚/氯仿抽提，能在迅速裂解组织或细胞的同时抑制细胞释放出的内源RNase，保持RNA的完整性，通过吸附柱获得RNA。手工磁珠法的原理是磁珠表面具有吸附作用的特定活性官能基团可特异高效地吸附核酸。将细胞裂解后，加入磁珠对核酸进行吸附，通过洗涤试剂纯化去除杂质获得纯净的核酸。但手工法RNA提取技术始终存在着耗时、繁琐、低效率等问题。

（2）自动化RNA提取技术

近年来分子诊断技术快速发展，实验的操作朝着更为简单和人性化的方向发展。分子诊断检测的样本类型多达数十种，而处理后RNA产物适用的检测项目也涵盖了荧光定量PCR、基因测序、基因芯片等各类分子生物学技术平台。然而，无论是哪一类检测项目，准确的检验结果无疑依赖于高质量的标本及标本前处理过程。磁珠法RNA提取试剂加自动核酸提取仪，就成为解决临床分子诊断样品前处理的组合。

4. 血液RNA样本手工提取VS自动提取

血液由血浆和血细胞两部分组成，血液RNA主要存在白细胞中，红细胞中有非常丰富的核糖核酸酶（RNase），会对RNA造成严重的降解，最大限度地降低RNase的影响是保证血液高质量RNA提取的关键。与手工法提取相比，自动化提取血液RNA操作更加简便、快速，可有效减少手工提取的操作失误，同时的降低外源性RNase的污染，确保所提RNA产物的质量和纯度。

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