冬的精灵跖起脚尖，掠过树顶，染红几片叶子，然后又乘着一簇飞掠过山谷离开。初冬的愁，结在了愈来愈孤立的寒枝上，化作片片飘零的红叶，融在了冬虫渐唱渐衰的悲鸣中。

通蔚给您讲解细胞培养三大步骤：

一、复苏

细胞复苏的原则： 快速融化

必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

实验前准备

将水浴锅提前预热至37℃。

细胞实验室进行常规消毒，用75％酒精擦拭紫外线照射40min的超净工作台台面，保证无菌。

在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等即将使用的耗材及试剂。

取出冻存管

根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的对应编号。

从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。

迅速解冻

迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。

约1-2min后冻存管内液体wan全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。

二、传代

1.传代密度过高

一旦细胞养太久至融合度过高（>90%）才传代，容易使细胞产生老化现象，甚至是堆叠，再消化细胞时不易吹打成单颗细胞，即便再重新铺盘传代，细胞也无法回到原本的特性了。（如：单层细胞，没长满就发生堆叠现象）。

解决方案

尽量避免融合度过高，镜下观察融合度约达到80%即可传代分盘。

细胞融合度：在细胞培养中指的是细胞在培养表面（培养皿/瓶）所占的比例。

2.传代密度过低

哺乳动物贴壁培养细胞，若细胞培养到 80-90%密度需要开始传代，在传代接种细胞密度过低，细胞间距离太远，就无法在细胞间产生黏附及通信作用，帮助信号传导并活化细胞；总体细胞量不足，分泌的生长因子浓度会不足以产生利于生长的微环境，以上皆会造成增殖速度迟缓或细胞死亡。

解决方案

细胞传代时，要进行准确的细胞计数，确保铺盘的密度。

三、冻 存

细胞冻存的基本原理： 慢冻

手动降温：将细胞依序放在4℃（30分钟）、-20℃（1小时）、-80℃（过夜）后移至液氮中保存。

程序降温盒：是一般最guang泛使用的降温法，为一种特制冷冻容器（填充异丙醇或依靠特制金属导热），使细胞以每分钟约-1℃的速度降至-80℃（过夜），然后移至液氮中保存。