细菌呼吸链复合物II活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

  细菌呼吸链复合物II（琥珀酸－辅酶Q还原酶）活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用合成辅酶Q同功类似物二氯酚靛酚，通过反应系统测定样品中二氯酚靛酚还原后吸光峰值的变化，即采用比色法测定样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种野生、培养或病原性细菌膜蛋白悬液样品的琥珀酸－辅酶Q还原酶的特异性活性检测。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

技术背景

细菌呼吸链复合物II，通常称为琥珀酸－辅酶Q还原酶或琥珀酸脱氢酶（Succinate-Coenzyme Q Oxidoreductase；Succinate Dehydrogenase；SQR），结构和功能上类同于线粒体复合物II，膜结合型，是细菌需氧呼吸链与三羧酸循环链接的主要元素：含有四个亚体，铁硫中心（Fe-S clusters），辅因子为黄素（flavin）。其最特征性的酶活性是噻吩甲酰三氟丙酮（thenoyltrifluoroacetone；TTFA）敏感的琥珀酸－辅酶Q还原酶。复合物II催化琥珀酸（succinate）被氧化为富马酸（fumarate），细菌内电子由供体黄素传递到内膜上辅酶Q受体（泛醌；ubiquinone）的能量转移反应，进行呼吸链传递。基于琥珀酸底物，通过琥珀酸－辅酶Q还原酶的催化，氧化为富马酸，同时氧化型二氯酚靛酚（dichlorophenal-indophenol；DCPIP）转化为还原型二氯酚靛酚（dichlorophenal-indophenol；DCPIPH2），在分光光度仪下产生吸光峰值的变化（600nm 波长），由此定量测定琥珀酸－辅酶Q还原酶的特异活性。其反应系统是：

产品内容

  缓冲液（Reagent A）         毫升

  反应液（Reagent B）         毫升

  阴性液（Reagent C）           毫升

  底物液（Reagent D）          微升

产品说明书               1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；  反应液（Reagent B）和  底物液（Reagent D），避免光照，有效保证6月

用户自备

比色皿：用于比色的容器

分光光度仪：用于比色分析

培养箱：用于孵育反应物

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；  缓冲液（Reagent A）室温预热；  反应液（Reagent B）和  底物液（Reagent D）注意避光。然后进行下列操作。

一、 测定准备

1． 准备好待测样品（例如细菌膜蛋白样品等），置于冰槽里 

2． 设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为600nm，间隔60秒，读数6次（共5分钟），并置零

二、 背景对照测定

1． 移取xx微升  缓冲液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入xx微升  反应液（Reagent B）

3． 加入xx微升  底物液（Reagent D）

4． 上下倾倒数次，混匀

5． 放进30℃培养箱里静置3分钟

6． 加入xx微升  阴性液（Reagent C）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放入分光光度仪检测，此为背景空对照：600波长读数0分钟－600波长读数1分钟或5分钟 

三、 样品活性测定

1． 移取xx微升  缓冲液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入xx微升  反应液（Reagent B）

3． 加入xx微升  底物液（Reagent D）

4． 上下倾倒数次，混匀

5． 放进30℃培养箱里静置3分钟

6． 加入100微升待测样品（注意：50微克细菌膜蛋白）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放入分光光度仪检测，此为样品活性读数：600波长读数0分钟－600波长读数1分钟或5分钟

四、 计算样品活性

注意事项

1． 本产品为21次操作，包括背景对照

2． 操作时，须戴手套

3．   反应液（Reagent B）含有毒性物质，避免直接用手接触

4． 系统操作过程中，背景测定只需1次

5． 如果增强酶活检测，建议使用细菌膜蛋白样品。推荐  线粒体复合物待测样品预处理试剂盒－10342

6． 加入样品启动反应后3秒内即刻比色测定

7． 96孔板测定初始读数（0分钟读数）0.5左右为理想状态；比色皿测定为1.0左右

8． 反应1分钟后比色测定值趋于稳定；测定值由高到低变化；测定可以持续5分钟

9． 测定值由高到低变化，即5分钟测定读数低于0分钟测定读数，表明有酶活性

10． 比色测定后，比色皿须清洗

11． 建议待测样本蛋白浓度为50微克/100微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；注意计算公式的调整

12． 呼吸链复合物II（琥珀酸－辅酶Q还原酶）单位活性定义为：在30℃，pH 7.5条件下，每分钟内能够还原1微摩尔合成辅酶Q同功类似物二氯酚靛酚（DCPIP）所需的酶量作为一个活性单位

13． 本公司提供系列细菌酶类技术产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测准确