细菌呼吸链复合物II活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

 细菌呼吸链复合物II（琥珀酸－辅酶Q还原酶）活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用合成辅酶Q同功类似物二氯酚靛酚，通过反应系统测定样品中二氯酚靛酚还原后吸光峰值的变化，即采用比色法测定样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种野生、培养或病原性细菌膜蛋白悬液样品的琥珀酸－辅酶Q还原酶的特异性活性检测。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

技术背景

细菌呼吸链复合物II，通常称为琥珀酸－辅酶Q还原酶或琥珀酸脱氢酶（Succinate-Coenzyme Q Oxidoreductase；Succinate Dehydrogenase；SQR），结构和功能上类同于线粒体复合物II，膜结合型，是细菌需氧呼吸链与三羧酸循环链接的主要元素：含有四个亚体，铁硫中心（Fe-S clusters），辅因子为黄素（flavin）。其最特征性的酶活性是噻吩甲酰三氟丙酮（thenoyltrifluoroacetone；TTFA）敏感的琥珀酸－辅酶Q还原酶。复合物II催化琥珀酸（succinate）被氧化为富马酸（fumarate），细菌内电子由供体黄素传递到内膜上辅酶Q受体（泛醌；ubiquinone）的能量转移反应，进行呼吸链传递。基于琥珀酸底物，通过琥珀酸－辅酶Q还原酶的催化，氧化为富马酸，同时氧化型二氯酚靛酚（dichlorophenal-indophenol；DCPIP）转化为还原型二氯酚靛酚（dichlorophenal-indophenol；DCPIPH2），在分光光度仪下产生吸光峰值的变化（600nm 波长），由此定量测定琥珀酸－辅酶Q还原酶的特异活性。其反应系统是：

Complex II

SUCCINATE  +  DCPIP  +  CoQ       →      FUMARATE  +  DCPIPH2  +  CoQH2

蓝色            无色

↑Abs 600 nm           ↓Abs 600 nm

产品内容

 缓冲液（Reagent A）         20毫升

 反应液（Reagent B）         2.5毫升

 阴性液（Reagent C）            2毫升

 底物液（Reagent D）         500微升

产品说明书                1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融； 反应液（Reagent B）和 底物液（Reagent D），避免光照，有效保证6月

用户自备

比色皿：用于比色的容器

分光光度仪：用于比色分析

培养箱：用于孵育反应物

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化； 缓冲液（Reagent A）室温预热； 反应液（Reagent B）和 底物液（Reagent D）注意避光。然后进行下列操作。

一、 测定准备

1． 准备好待测样品（例如细菌膜蛋白样品等），置于冰槽里 

2． 设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为600nm，间隔60秒，读数6次（共5分钟），并置零

二、 背景对照测定

1． 移取780微升 缓冲液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入100微升 反应液（Reagent B）

3． 加入20微升 底物液（Reagent D）

4． 上下倾倒数次，混匀

5． 放进30℃培养箱里静置3分钟

6． 加入100微升 阴性液（Reagent C）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放入分光光度仪检测，此为背景空对照：600波长读数0分钟－600波长读数1分钟或5分钟 

三、 样品活性测定

1． 移取780微升 缓冲液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入100微升 反应液（Reagent B）

3． 加入20微升 底物液（Reagent D）

4． 上下倾倒数次，混匀

5． 放进30℃培养箱里静置3分钟

6． 加入100微升待测样品（注意：50微克细菌膜蛋白）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放入分光光度仪检测，此为样品活性读数：600波长读数0分钟－600波长读数1分钟或5分钟

四、 计算样品活性

【（样品读数－背景读数）X 1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数】÷【0.1（样品容量；毫升）X 21.8（毫摩尔吸光系数 X 1或5（反应时间；分钟）】＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克

单位＝微摩尔二氯酚靛酚/分钟

注意事项

1． 本产品为21次操作，包括背景对照

2． 操作时，须戴手套

3．  反应液（Reagent B）含有毒性物质，避免直接用手接触

4． 系统操作过程中，背景测定只需1次

5． 如果增强酶活检测，建议使用细菌膜蛋白样品。推荐 线粒体复合物待测样品预处理试剂盒－GMS10342

6． 加入样品启动反应后3秒内即刻比色测定

7． 96孔板测定初始读数（0分钟读数）0.5左右为理想状态；比色皿测定为1.0左右

8． 反应1分钟后比色测定值趋于稳定；测定值由高到低变化；测定可以持续5分钟

9． 测定值由高到低变化，即5分钟测定读数低于0分钟测定读数，表明有酶活性

10． 比色测定后，比色皿须清洗

11． 建议待测样本蛋白浓度为50微克/100微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；注意计算公式的调整

12． 呼吸链复合物II（琥珀酸－辅酶Q还原酶）单位活性定义为：在30℃，pH 7.5条件下，每分钟内能够还原1微摩尔合成辅酶Q同功类似物二氯酚靛酚（DCPIP）所需的酶量作为一个活性单位

13． 本公司提供系列细菌酶类技术产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测准确