细胞β氨基己糖苷酶（β-hexosaminidase）活性比色法定量检测试剂盒

产品说明书（中文版）

主要用途

  细胞β氨基己糖苷酶（β-hexosaminidase）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过底物PNP-NAG受到β氨基己糖苷酶催化水解后，在碱性环境下，呈现黄色，即采用比色法来测定样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物和人体细胞裂解悬液样品中β氨基己糖苷酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

β氨基己糖苷酶（β-hexosaminidase；EC3.2.1.52）.又称为N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（N-acetyl--β-D-Glucosaminidase；NAGase）属于含有20个糖苷水解酶（glycoside hydrolase）家族，也是肽聚糖水解酶，为溶酶体细胞器中的酶之一。其功能在于水解N-乙酰-β-D-氨基己糖苷中的末端N-乙酰-β-D-氨基己糖残基（N-acetyl-D-hexosamine   residues），参与细胞内糖蛋白和糖脂的分解代谢，包括蛋白和中性糖脂中的寡糖、粘多糖等水解。具有宿主抗感染防御作用。β氨基己糖苷酶为同源二聚体结构，有α和β两个亚体构成：HEXA和HEXB。人体缺乏HEXA或HEXB，将导致神经退行性相关的疾病，例如家族黑蒙性?。?/span>Tay-Sachs?。┖?/span>神经节苷脂贮积病  （Sandhoff 病）。 基于底物4-硝基苯基 N-乙酰-β-D-葡萄糖胺（4-Nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide；PNP-NAG），在β氨基己糖苷酶的作用下，水解释放出硝基苯酚（p-nitrophenol）和N-乙酰-β-D-葡萄糖胺（N-acetyl-β-D-glucosamine；NAG），在碱性环境下，呈现出黄色，在分光光度仪下，产生吸光峰值变化（405nm 波长），来定量分析β氨基己糖苷酶的活性。其反应系统为：

产品内容

  缓冲液（Reagent A）         毫升

  反应液（Reagent B）         毫升

  碱性液（Reagent C）           毫升

  阴性液（Reagent D）           微升

  清理液（Reagent E）         毫升

  裂解液（Reagent F）         毫升

产品说明书               1份

保存方式

保存  反应液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品操作的容器

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

细胞刮脱棒：用于细胞脱离

（微型）台式离心机：用于样品操作

比色皿或96孔板：用于比色分析的容器

分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤

一、 样品准备

1． 准备好75cm²细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁷细胞）

2． 小心加入xx毫升  清理液（Reagent E），覆盖生长表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）

5． 加入xx毫升  清理液（Reagent E），混匀细胞

6． 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）

7． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升  裂解液（Reagent F），充分混匀

10． 转移到预冷的1.5毫升离心管

11． 强力涡旋震荡15秒

12． 置于冰槽里孵育30分钟

13． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管

15． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用   Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－   30030.1）

16． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、 测定准备

1． 准备好待测样品（例如细胞裂解萃取悬液样品等），置于冰槽里

2． 设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长405nm，并置零

3．   缓冲液（Reagent A）室温下均衡温度

三、 背景对照测定

1． 移取xx微升  缓冲液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入xx微升  反应液（Reagent B）

3． 加入xx微升  阴性液（Reagent D）

4． 上下倾倒数次，混匀

5． 在37℃温度下孵育10分钟

6． 加入xx微升  碱性液（Reagent C）

7． 上下倾倒数次，混匀

8． 在37℃温度下孵育5分钟

9． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照

四、 样品测定

1． 移取xx微升  缓冲液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入xx微升  反应液（Reagent B）

3． 加入50微升待测样品（50微克蛋白）（注意：样品须清澈，且pH小于7.5）

4． 上下倾倒数次，混匀

5． 在37℃温度下孵育10分钟

6． 加入xx微升  碱性液（Reagent C）

7． 上下倾倒数次，混匀

8． 在37℃温度下孵育5分钟

9． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数 

四、计算样品活性

五、 酶标仪测定

1． 在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品

2． 分别移取xx微升  缓冲液（Reagent A）到相应孔里

3． 分别加入xx微升  反应液（Reagent B）

4． 分别加入xx微升  阴性液（Reagent D）或待测样品（20微克蛋白）（注意：样品须清澈，且pH小于7.5）

5． 轻轻摇动96孔板

6． 在37℃温度下孵育10分钟

7． 分别加入xx微升  碱性液（Reagent C）

8． 轻轻摇动96孔板

9． 在37℃温度下孵育5分钟

10． 即刻放进酶标仪检测 

11． 活性计算

注意事项

1． 本产品为20次操作，包括背景对照

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，背景测定只需1次

4． 样品须澄清，至关重要

5． 建议使用比色皿测定

6． 加样后3秒内比色测定

7． 测定值由低到高变化；测定可持续10分钟

8． 比色测定后，比色皿须清洗

9． 样本测定10分钟读数高于0分钟读数表明具有酶活性

10． 建议待测样本蛋白浓度为50微克/50微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量（本公司提供    Bradford蛋白质浓度定量试剂盒    30030.1）

11． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

12． β氨基己糖苷酶单位活性定义为：在37℃，pH 4.25条件下，每分钟内能够释放1微摩尔硝基苯酚所需的酶量作为一个活性单位

13． 本公司提供系列细胞酶学检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测敏感