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 细菌呼吸链复合物3（bc-1 complex）活性光度法定量检测试剂盒产品说明书

（中文版）

主要用途

 细菌呼吸链复合物3（bc-1 complex）活性光度法定量检测试剂是一种旨在使用还原性合成辅酶Q同功类似物和特异性抑制剂，通过反应系统测定样品中细胞色素C还原后峰值的增高，即采用比色法测定样品中酶活性的而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种野生、培养或病原性细菌膜蛋白悬液样品的辅酶Q-细胞色素C还原酶的特异性活性检测。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

技术背景

细菌呼吸链复合物III，通常称为辅酶Q－细胞色素C还原酶、细胞色素还原酶或bc1复合物（ubiquinol cytochrome c oxidoreductase；cytochrome reductase；bc1 complex），是细菌电子传递链的中心元素，位于革兰氏阴性和阳性细菌（除大肠杆菌和古生菌等），包括光合成细菌的细胞膜上，为寡聚体膜蛋白复合物。细菌使用氧气、氮、硫化物等作为终端电子受体。细菌复合物III含有三个亚单位，包括细胞色素b（Cytochrome b），细胞色素c1（cytochrome c1）和Rieske铁硫蛋白（Rieske iron-sulfur protein），通过Q循环（Q cycle）进行催化作用。其特征性的酶活性是抗霉素敏感的辅酶Q－细胞色素C还原酶。复合物III催化氧化型细胞色素C被还原为还原型细胞色素C，细菌内电子由低电位的供体还原型泛醌（ubiquinol；UQH2）或还原型辅酶Q（reduced Coenzyme Q；CoQH₂）传递到细胞色素C或质体蓝素（plastocyanin）上的能量转移反应，进行呼吸链传递。细菌复合物3和复合物4的相互作用，形成泛醌氧化酶（quinol oxidase）。辅酶Q－细胞色素C还原酶反应系统测定氧化型细胞色素C的浓度变化。基于还原型泛醌或还原型辅酶Q底物，在抗霉素存在与否的情况下，通过辅酶Q-细胞色素C还原酶的催化，转化成泛醌（ubiquinone；UQ）或辅酶Q（Coenzyme Q；CoQ），同时氧化型细胞色素C，转化为还原型细胞色素C，在分光光度仪下产生吸光峰值的变化（550nm 波长），由此定量测定辅酶Q－细胞色素C还原酶的特异活性。其反应系统是：

产品内容

 缓冲液（Reagent A）         毫升

 反应液（Reagent B）            微升

 阴性液（Reagent C）         毫升

 底物液（Reagent D）         微升

 专性液（Reagent E）         微升

 稳定液A（Reagent F1）         管

 稳定液B（Reagent F2）         毫升

产品说明书             1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；  反应液（Reagent B）和  底物液（Reagent D），避免光照，有效保证3月

用户自备

比色皿：用于比色的容器

分光光度仪：用于比色分析

培养箱：用于孵育反应物

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；  反应液（Reagent B）和  底物液（Reagent D）注意避光。

一、 测定准备

1． 准备好待测样品（例如细菌膜蛋白样品等），置于冰槽里

2． 设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为550nm，间隔60秒，读数3次（共2分钟），并置零

3．  缓冲液（Reagent A）室温下均衡温度

4． 实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的  稳定液B（Reagent F2）置入冰槽里融化，然后移出xx毫升到  稳定液A（Reagent F1）管里，混匀后，标记为  稳定工作液，置于冰槽里备用（注意，15分钟内使用，用完后丢弃）。然后将－20℃冰箱里的试剂盒中的  反应液（Reagent B）室温下融化，然后移出10微升到新的1.5毫升离心管，加入xx微升  稳定工作液，轻柔混匀后，室温下避光静置15分钟（可见颜色变白），标记为  反应工作液。然后即刻进行下列操作。

二、 背景对照测定

1． 移取xx微升  缓冲液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入10微升  反应工作液

3． 加入xx微升  底物液（Reagent D）

4． 室温下静置10分钟，避免光照

5． 加入xx微升  阴性液（Reagent C）

6． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

7． 即刻放入分光光度仪检测，此为背景空对照：550波长读数1分钟或2分钟－550波长读数0分钟

三、 样品总活性测定

1． 移取xx微升  缓冲液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入10微升  反应工作液

3． 加入xx微升  底物液（Reagent D）

4． 室温下静置10分钟，避免光照

5． 加入100微升待测样品（注意：15微克细菌膜蛋白）

6． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

7． 即刻放入分光光度仪检测，此为样品总活性读数：550波长读数1分钟或2分钟－550波长读数0分钟

四、 样品非特异活性测定

1． 移取xx微升  缓冲液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入10微升  反应工作液，避免光照

3． 加入xx微升  底物液（Reagent D）

4． 室温下静置10分钟，避免光照

5． 加入xx微升  专性液（Reagent E）

6． 加入100微升待测样品（注意：15微克细菌膜蛋白）

7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8． 即刻放入分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：550波长读数1分钟或2分钟－550波长读数0分钟

五、 计算样品活性

1）样品活性（总活性和非特异活性）

2）样品特异活性

注意事项

1． 本产品为21次操作（10个样本），包括1次背景对照测定

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，背景测定只需1次

4． 如果增强酶活检测，建议使用细菌膜蛋白样品。推荐使用  细菌呼吸链复合物检测样品制备试剂盒－GMS15142

5． 每增加1个样品，增加  反应工作液为：  反应液（Reagent B）5微升＋  稳定工作液5微升，以此类推。配制反应工作液时，须根据样本数量配制实际工作液容量

6． 用户可以根据实际样品，计算  缓冲液（Reagent A）、  反应工作液和  底物液（Reagent D）三者之和，混匀后，室温下静置10分钟后，即刻检测

7． 加入样品启动反应后3秒内即刻比色测定

8． 分光光度计波长严格设置在550nm，误差10nm将不产生信号

9． 测定可以持续2分钟

10． 测定值由低到高变化，即2分钟测定读数高于0分钟测定读数，表明有酶活性

11． 比色测定后，比色皿须清洗

12． 建议用户使用分光光度仪检测，总体系减半可以增加检测样本数

13． 建议待测样本膜蛋白浓度为15微克/100微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；注意计算公式的调整（本公司提供   Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）

14． 如果使用细菌裂解悬液，则蛋白浓度为50微克/100微升

15． 样品特异活性是指抗霉素敏感的辅酶Q－细胞色素C还原酶，去除其它干扰因素（例如复合物I/II/IV等）

16． 细菌呼吸链复合物III（辅酶Q－细胞色素C还原酶）单位活性定义为：在30℃，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型泛醌（CoQH₂）所需的酶量作为一个活性单位

17． 本公司提供系列细菌酶类技术产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测准确