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在共聚焦显微镜中，测定共定位的能力受限于光学系统的分辨率及用于照明样品的入射光波长?？沓∮夂凸簿劢瓜晕⒕道砺鄯直媛试嘉?00nm，但在实际上，由于各种原因这个数降到400nm和600nm之间，原因包括显微镜光路未*对准、光学折射率波动、光学像差及样品制备的不合适。然而，对于一个已经*调好的共聚焦显微镜来说，两个荧光分子是否连接到同一个目标对象上，或者它们是否定位在同一个器官上受光学分辨率影响。共定位的许多实验是围绕高特异性的合成探针和抗体进行的，标记目标是容易区分的局部的、明确的细胞结构。
共聚焦显微镜的扫描器内密封有检测针孔光栏、分光镜、发射荧光分色器及检测器。当荧光样品中的混合荧光进入扫描器，经过检测针孔栏、分光镜和分色器选择后，被分成各单色荧光，分别在不同的荧光通道进行检测并形成相应的共焦图像，同时在计算机屏幕上可以显示几个并列的单色荧光图像及其合成图像。
针孔是共聚焦显微镜中的一个重要组成部分，它是放在检测器及激光光源前面的一个小孔，作用是控制光切片的厚度，对实现断层扫描成像，排除焦面杂散光起关键作用；
分光镜的作用是按照波长来改变光线的传播方向；
发射荧光分色镜的作用是选择出一定的波长范围的光进行检测，不同型号的仪器采用的分色器的部件有所不同。目前用于分色器的部件主要由滤光片、棱镜和光栅三种类型；
检测器采用高灵敏度的光电倍增管，其检测的范围和灵敏度可根据强度进行连续调节。
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