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怎样选择高 效 液 相色谱柱

现代液相色谱中，分离效果好坏很大程度上取决于色谱填料的选择中。但是色谱填料的选责范围很宽，要做合适的选择，必须对此有一定的认识和了解。

  一．           硅胶基质填料   

1，  1，  正相色谱

正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica），以及其他具有极性官能团，如胺基团

（ZH₂,APS）和氰基团（CN，CPS）的键合相填料。

 由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他团的极性教强，因此，分离的次序是依据样品中的各组份的极性大小，即极性强落的组份zui先被冲洗出色谱柱。

正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如：正乙烷（Hexane）,氯（Chloroform） 二氯甲烷（Methylence  Chloride）等.

2反相色谱

反相色谱填料常是以硅胶为基础，表面键合有极性相对教弱的官能团的键合相。

反相色谱所使用的流动相极性教强，通常为水，缓冲液与甲醇，已腈等混合物。

样品流出色谱柱的顺序是极性教强组合zui先被冲出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。

常用的反相填料有C18（ODS） C8（MOS）。C4（B）C₆H₅（Phenyl）等。

二聚合物填料

聚合物调料多为聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙酸至等，其主要优点是在PG值为1-14均可使用。

相对与硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的淑水性；大孔的聚合物填料对蛋白质等样品的分离非常有效。

现在的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效教低。

三.其他无机填料

其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化。由于其特殊的性质，一般于特殊的用途。如墨化碳也用于正逐渐成为反相色谱填料。这种填料的分离不同与硅胶基质烷基键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性，该柱填料一般比烷基键合硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强，石墨化碳可用于分离某些几何导构体，又由于HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可用于HPLC，氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可在PH高达12的流动相中使用。但由于氧化铝与碱性化合物作用也很强，应用范围受到一定的限制，所以未能广泛应用，新型氧化诰填料也可用于       HPLC，商品化的仅有聚合物涂层的多孔氧化诰微球色谱柱，应用PH范围1~14，温度可达到100⁰C。由于氧化诰填料几年才开始研究，加之前的实验难度，其重要用途与优势尚在进行中。

怎样选择填料粒度

目前，商品化的色谱料粒度从1um到超过30um均有销售，而目前分析分离主要用3,5和10um填料，填料的粒度主要影响填充柱的两个参数，即柱效和背压。粒度越小，填充柱的柱效越高；小于3um的填料应用，在相同选择性条件下，提高柱效可提高分离度，但不是*的因素。如果固定相选择是真确，但是分离度不够，那么选择更小粒度的填料是很用有的，3um填料填充柱的柱数比相同条件下的5UM填料的柱效提高近30%；然而；3um的色相谱的背压却是5um的2倍。与此同时，柱效提高意味着在相同条件下可以选择更短的色谱柱，以缩短分析时间，另外，可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使用温度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色谱柱的压力。

如何保证良好的柱性能与柱寿命

ü       ü       认证阅读色谱柱使用说明书

ü       ü       使用填充良好的色谱柱；

ü       ü       尽量减少压力波动，避免机械及热冲击

ü       ü       使用?；ぶ霸谙吖似?/span>

ü       ü       经常以强溶剂冲洗色谱柱

ü       ü       充分过滤样品及流动相，尽量避免杂质微粒与保强留分成

ü       ü       用稳定的固定相（C18zui稳定）

ü       ü       在中等PH纸操作（6~8），用有机年成液溶；

ü       ü       色谱柱使用温度小于40⁰C

ü       ü       硅胶基质的的色谱柱，应保持流动相的PH值范围在3.0~8.0

ü       ü       在水流动相与缓冲浓液中加200ppm的叠氮钠

ü       ü       流动相中含有缓冲溶液，应注意应95∶5的水及有机溶剂过渡，有机溶剂不能低于5%

ü       ü       过夜或储存时，冲洗掉盐和缓冲液，用纯有机溶剂流动相保存（乙晴）.。

HPLC固定相及应用范围、

姓名   性别    功能基团     正相  反相  离子对      应用

Silica           -OH           √                非极性和中等极性以及非离子性有机化合物。

SAS     C1     -（CH₃）₃            √            在所有的烷基键合相中对非极性化合物保留zui弱，典型用于中等极性和多官能团化合物

Buty1   C4      -C₄H₉             √      √       分离肽和蛋白质，保留时间比C8和C18短

MOS    C8      -C₄H₉             √     √        中等极性相中对中等化合物，小肽和蛋白质，极性药，0族化合物和环境样品

ODS    C18，O                    √     √       烷基键合相中对中等极性化合物保留zui强。广泛用于药物，0族化合物，脂肪酸和环境样品

CPS   CN ，C              √   √               对极性化合物有*的选择性，适合应用于正相分离，当用于反相系统时，其选择性与C8和C18不同，在药学领域和复杂混合物的分离中应用广泛。

APS     NH             √     √                     反相中分析糖类和其他极性化合物。弱阴离子交换，阴离子和有机酸则应用缓冲剂和机改性剂做流动相，正相中与硅胶的选择性不同，分析芳香族效果很好

                                                 芳香族化合物

PD                                              反向时，分离胎和蛋白质。正相时，与硅选择性相似

SCX  强阳离子交换                                          有机碱

SAX   强阴离子交换                                     有机酸，核苷和核苷酸

如何解决色谱柱使用过程中出现的问题

一．一．保留值与分离度重现性不好原因分析

问题                 原因                         表现

不同色谱柱间差异使用期间柱的变化             填料，键合相不同柱床破坏键合相丢失硅胶基质溶解，强保留分堆积堵塞               保留因子（K）分离子（）柱效（N）

                                             保留因子（K）柱效（N）

柱外效应                                     系统差易，进样量大，进样0与色谱柱之间，色谱柱与检测器之间管路太长，检测器流通池体积大，接头死体积大等         注效（N）

分离效果变差      流动相组分改变            保留因子（K）柱效变化很小

                  流速改变                  保留因子（K）  分离因子

                  温度改变                  保留因子（K）柱效变化很小

柱平衡慢         重新平衡时间不够           保留因子（K）柱效变化很小

柱超载           样品量太大                 保留因子（K）  注效（N）

二 、造成色谱峰（不对称）拖尾的原因

1.色谱柱本身填装问题，筷板堵塞或填料塌陷  

2.柱头有污染；

3样本超载；

4样品溶剂不合适]

5.柱外效应

6化学或二次保留（硅基）效应

7缓冲容量不足或不合适

8重金属污染

三、如何解决峰形拖尾的问题

A.   与化学有关的拖尾问题

1  .流动相中，加入30MM的三乙胺（用与碱性化合物）或醋酸胺（用与酸性化合物），未知化合物加醋酸三乙胺

2如然拖尾，将三乙胺换为二甲基辛胺（或醋酸二甲基辛胺）；

3.降低进样量至〈1UG。

B．与色谱柱有管的拖尾问题

1如柱头处有强保留的样品组分积聚，反相柱可用20倍柱体积的96%的二碌甲烷与4%甲醇，家1%氢氧化铵混合液冲洗，正向柱可用甲醇冲洗。

2.使用?；ぶ?/span>

C.与HPLC 系统有关的蜂拖尾和峰加宽

1.进样体积过大，通?！?/span>25UL〉

2.进样0与色谱柱及检测器之间的管路体积过大（*连接管应〈20CM，内径为0.007〉

3检测器流通池的体积过大

四、如何储存色谱柱

1防止缓冲溶液和水溶液流动相产生微生物，做到流动相用多少配多少，或在水流动相中加200PPM的叠0钠以抑制细菌成长（一定当心其毒性和潜在的爆炸性）；或在流动相中家20%的有机改性剂，也可抑制微生物生长，有机改性剂还有助于流动相脱气。

2.尽可能将色谱柱储存于100%有机溶剂（乙晴）中，避免在缓冲溶液中保存。

3.使用缓冲溶液后的色谱柱，应用15`20陪柱体积的不含缓冲剂的同种水—有机溶剂流动相冲洗色谱柱，后换成100%有机溶剂储存。

4避免用纯净水冲洗键合致密的C18柱。

5将色谱柱的两端用堵有拧好，以免柱床填料干裂。

五、如何选择?；ぶ?/span>

  怎样选择?；ぶ?，但又不能影响分离分析？这是色谱工作者经常提出的一 个问题。通常，在选择?；ぶ笆紫纫悸堑氖茄肥欠袂褰?。对于大部分分析工作者来说，一只1CM

长的?；ぶ?，那么就应选择2CM或3CM长的?；ぶ?，保护柱越长，自然所装添的色谱柱的机会。当然，随着?；ぶ某ざ燃映ぃ返谋Ａ羰奔浠岜仁褂枚瘫；ぶ?。一般来说，?；ぶ哪诰队敕治錾字哪诰断嗤蛳嗟奔纯?。

  ?；ぶ奶盍献疤罘绞揭埠苤匾?。目前有薄膜装填法的?；ぶ褂霉毯芗虻シ奖?，而且可以在实验室中进行干装。但是，其zui大的缺点是不经济，特别是针对中国的具体情况，一次性使用相对费用较高。另外，薄膜装填法的保护拄所装填的色谱填料有限，只能提供有限的?；ぷ饔谩２还惨蛭疤畹纳琢辖仙?，?；ぶ某ざ纫步潭?，所以对分析样品的保留时间的影响也很小。

另一种?；ぶ峁蛊涫抵适撬醵塘说纳追治鲋?，设计方式上有直连式、手紧式或整替式。整体式设计是有色谱的生产厂商直接安装在色谱分析柱上的，必须与色谱分析柱一同订货，可以非常方便地使用，但不能够被修改。直连式结构设计可在任何时候有色谱工作着来安装连接，可以与任何品牌的色谱分析柱连接使用，而且还可以根据样品的相关情况选择不同的?；ぶざ?。手上紧即可。另外从?；ぶ峁褂址治欠窨梢愿槐；ぶ?，可以降低保护柱的使用成本。

大多数人是根据色谱分析柱的填料选择?；ぶ奶盍希Ｇ榭鱿驴梢匝≡裼敕治錾字谎纳滋盍?。但是，根据实际是分析工作，也可不必与分析色谱的 填料*相匹配。

  对于选择?；ぶ脑蚴?；在满足分析分离要求的前提条件，尽可能的选择较短的?；ぶ峁埂＞】赡苎≡穸苑掷胙沸∫恍┍Ａ粜缘奶盍?。

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