上海通蔚生物的夹心 ELISA 测定两层抗体（捕获抗体和检测抗体）之间的抗原。目标抗原必须包含至少两个能够结合到抗体的抗原表位。夹心 ELISA 省去了分析之前的样品纯化步骤，而且提高了分析灵敏度（灵敏度比直接或间接 ELISA 高 2-5 倍）。

单克隆或多克隆抗体均可在夹心 ELISA 系统中用作捕获抗体和检测抗体。单克隆抗体识别单一表位，可对抗原中微小差别进行定量检测。多克隆抗体通常用作捕获抗体以沉降尽可能多的抗原。

操作步骤：

用捕获抗体包被

1. 用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液 (pH 9.6) 中浓度为 1–10 μg/mL 的捕获抗体包被 PVC 微量滴定板的样品孔。

如果使用未纯化抗体（例如腹水或抗血清），可能需要提高样品蛋白质的浓度（尝试 用10 μg/mL）来补偿较低浓度的特异性抗体。

2. 用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在 4 ℃ 下孵育过夜。

3. 弃去包被液，并洗涤微量滴定板两次，每次在微孔中加入 200 μL PBS。在水槽上方轻轻甩动微量滴定板，除去溶液或洗涤液。在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴。

封闭和加样

1. 每孔添加 200 μL 封闭缓冲液（5% 脱脂奶粉/PBS），封闭包被孔中剩余的蛋白质结合位点。

2. 用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育至少 1-2 小时，或在 4 ℃ 下孵育过夜。

3. 用 200 μL PBS 洗涤微量滴定板两次。

4. 每孔添加 100 μL 经过稀释的样品。通常将未知样品的信号与标准曲线的信号进行比较。每个板都必须测定标准品（两重测定或三重测定）和空白样。在 37 ℃ 下孵育 90 分钟。

5. 弃去样品，用 200 μL PBS 洗涤微量滴定板两次。

我司确保标准品的浓度涵盖抗体结合的大部分动态检测范围。可能需要优化浓度范围以确?；竦煤鲜实谋曜记摺Ｑ泛捅曜计吠ǔ２扇×街夭舛ɑ蛉夭舛?。

检测抗体和二抗孵育

1. 每孔添加 100 μL 经过稀释的检测抗体。

确保检测抗体识别与捕获抗体不同的靶蛋白上的表位。这能避免抗体结合受到干扰。尽可能使用已测试的匹配抗体对。

2. 用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育 2 小时。

3. 用 PBS 洗涤微量滴定板四次。

4. 添加 100 μL 偶联二抗，其在使用之前便用封闭缓冲液进行稀释。

5. 用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育 1-2 h。

6. 用 PBS 洗涤微量滴定板四次。

检测辣根过氧化物酶 (HRP) 和碱性磷酸酶 (ALP) 是 ELISA 分析中使用的两种酶，例如肺泡细胞中的高水平 ALP、红细胞中的高水平过氧化物酶），这可能会导致非特异性信号。如有必要，用左旋咪唑（针对 ALP）或用 0.3% H2O2 的甲醇溶液（针对过氧化物酶）进行另外的阻断处理。