哺乳动物蛋白抽提试剂盒说明书

Mammalian Protein Extraction Kit

货号： K0889   

保存：蛋白酶抑制剂混合物：-20℃

   其它 组分：室温   

组分说明

Catalog no.                     K0889      K0889A

Kit Size                       25  次      100  次

Mammalian Protein Extraction Reagent     25 ml        100 ml

蛋白酶抑制剂混合物                 250  μl       1 ml

产品简介

      哺乳动物蛋白抽提试剂能够快速，温和，高效的裂解哺乳动物细胞，有效提取细胞浆和细胞核蛋白。该试剂使用温和配方保证所提取蛋白保持生物学活性并可应用于多种蛋白分析试验，如：报告基因和酶活性测定，免疫检测，蛋白纯化等。提取后蛋白可采用          BCA  法进行蛋白定量分析。哺乳动物蛋白抽提试剂盒中带有蛋白酶抑制剂混合物，可有效避免蛋白提取过程中蛋白的降解。

注意事项

 1. 本产品可有效裂解细胞培养板培养的贴壁细胞（无需刮?。┮约袄胄氖占男∠赴?，较反复冻融或超声法具有更高提取效率。但对于组织蛋白的抽提，建议使用组织蛋白抽提试剂（#K0004，#K0891）。

 2. 表一中所列的是贴壁细胞蛋白提取的J使用量，如果需要减少试剂用量从而获得更高的蛋白浓度，建议首先刮取细胞。

 3. 对于离心获得的细胞，如果丌知道细胞的体积，可以根据细胞数量估计抽提试剂的使用量。如2×10⁶个Hela 细胞约重20 mg，需要加入200μl 抽提试剂，以此类推。

 4. 通过本产品提取的蛋白，可通过BCA法进行蛋白定量分析。

操作步骤        

 ●  贴壁细胞蛋白抽提

 1.  小心倾去贴壁细胞的培养液。

 2.  注意：如培养基中含有酚红或其他可能影响试验结果的物质，请先使用PBS漂洗细胞。

 3.  请在蛋白抽提前取出实验所需蛋白抽提试剂进行预冷， 按照1:99比例加入蛋白酶抑制剂混合物（例如990μl抽提试剂中加入10μl蛋白酶抑制剂混合物），使蛋白酶抑制剂混合物在抽提试剂中成1×工作液。

注意：在进行蛋白抽提前2-3分钟内加入蛋白酶抑制剂混合物。

 4.  加入适量哺乳动物蛋白抽提试剂，（在冰上用枪头吹打贴壁细胞，将裂解液转移至离心管中），冰上孵育20分钟，让细胞充分裂解（试剂使用量请参考附表1，冰上放置时间应根据细胞类型丌同进行调整）。

 5.  14,000×g离心5-10分钟。

 6.  转移上清液至新管中，用于进一步分析。

 ●  悬浮细胞蛋白提取

 1. 将悬浮细胞2,500×g，离心10分钟，弃去上清。

 2. 可选步骤：漂洗。如培养基中含有酚红或其他可能影响实验结果的物质，请使用PBS漂洗细胞。

 3. 漂洗后的细胞悬浮液2,500×g，离心10min，弃去上清。

 4. 请在蛋白抽提前取出实验所需蛋白抽提试剂进行预冷，                             按照1:99比例加入蛋白酶抑制剂混合物（例如990μl抽提试剂中加入10μl蛋白酶抑制剂混合物），使蛋白酶抑制剂混合物在抽提试剂中成1×工作液。

注意：在进行蛋白抽提前2-3分钟内加入蛋白酶抑制剂混合物。

 5. 加入适量哺乳动物蛋白抽提试剂，每100 mg (~100 µl)细胞至少加入1 ml哺乳动物蛋白抽提试剂。如提取的样本量较大，可首先使用抽提试剂总使用量的1/10重悬细胞沉淀，然后加入剩余抽提试剂。

 6. 吹打均匀后，冰上放置20分钟，让细胞充分裂解（冰上放置时间应根据细胞类型丌同进行调整）。                                                 

7. 14,000×g离心15分钟。

8. 转移上清至新管中，进行下一步分析。

 注：每100 mg细胞约可提取到6 mg的总蛋白（细胞类型丌同略有差异）。                      

参考附表

                                            表  1. 抽提试剂使用量推荐表

细胞培养板类型或平皿类型                     抽提试剂使用量

100 mm                         500-1,000 µl

60 mm                           250-500 µl

6 孔培养板                         200-400 µl /孔

24 孔培养板                         100-200 µl /孔

96 孔培养板                          50-100 µl/孔

* 对于  100 mm  培养板培养的10⁷个细胞  (50 mg)可裂解获得约3 mg 总蛋白（细胞类型不同略有差异）。            

 2. 常见问题及解决办法

 1. 低提取率

可能原因：

a低蛋白表达量

b试剂使用量不够

c试剂无法溶解细胞膜

解决方法：

a优化转染系统

b增加抽提试剂使用量

c增加裂解时间或者加大晃动幅度

2. 无法获得膜蛋白  

可能原因：用哺乳动物蛋白抽提试剂提取核/浆蛋白  

解决方法：使用真核细胞膜蛋白抽提试剂盒                                                                                                               

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