植物染色质免疫沉淀分析（CHIP）试剂盒

产品说明书

主要用途

植物染色质免疫沉淀分析（CHIP）试剂是一种旨在通过甲醛交联、物理或化学处理细胞核以及染色质，从而运用特异抗体结合免疫沉淀，然后萃取DNA，扩增分析，来确定结合蛋白的目标DNA序列的而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于DNA复制、重组、修复、转录、病毒组装中的DNA和蛋白质（包括转录因子、聚合酶、组蛋白等）的相互作用的研究。广泛应用于定性检测各种植物组织（花瓣、叶片、种子等）DNA蛋白结合序列和定量检测序列特异性DNA结合蛋白（例如转录因子）及其突变形成等。产品即到即用，性能稳定，操作便捷，反应敏感，结合显著，重复性好。

技术背景

DNA和蛋白质的相互作用是调控细胞反应过程的要素之一。染色质免疫沉淀分析方法（chromatin immunoprecipitation；CHIP）是研究活体内（in vivo）DNA和蛋白质的相互作用的有力的工具：用于分析染色质结构动力学、转录因子调节、以及表观遗传学变异等。CHIP技术通过三大步骤实现：*，甲醛固定后染色质分离和断片；第二，运用特异蛋白之抗体，免疫共沉淀结合蛋白（包括转录因子、聚合酶、组蛋白等）的染色质片断；第三，分析目标DNA和蛋白的修饰。其中转录因子作为调节蛋白，通过结合核DNA，以达到控制基因表达。

产品内容

保存方式

保存裂解液A（Reagent D）、裂解液B（Reagent E）、裂解液C（Reagent F）、核溶液（Reagent G）、稀释液（Reagent H）、结合液（Reagent I）、解联液（Reagent O）、酶解液（Reagent P）、萃取液（Reagent Q）、浓缩液（Reagent R）和扩增液（Reagent U）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里； 有效保证6月

用户自备

特异抗体：用于目标蛋白的结合

特异引物：用于目标DNA的扩增或测序

1.5毫升离心管：用于样品反应操作和保存的容器

2毫升离心管：用于样品反应操作和保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器

50毫升锥形离心管：用于植物组织处理的容器

恒温水槽：用于孵育反应物

震荡器：用于混匀反应物

4℃微型台式离心机：用于沉淀样品

4℃台式离心机：用于沉淀样品

平式摇荡仪或摇床：用于孵育和混匀反应

DOUNCE匀浆器：用于裂解植物组织细胞

超声仪：用于裂解植物组织细胞核

PCR仪：用于扩增反应

电泳仪：用于检测扩增产物

实验步骤

实验开始前，准备好待测植物的预处理：药物处理等。同时将－20℃保存的试剂置于冰槽里融化。然后进行下列操作。

一、 植物组织细胞核分离

1． 准备好新鲜处理的植物组织（花瓣、叶片、种子等），并秤重1克组织重量

2． （选择步骤）放进预冷的50毫升锥形离心管

3． （选择步骤）加入 毫升清理液（Reagent A）清洗1次

4． 即刻用刀片切碎组织

5． 或置于液氮管过一夜，次日取出后，即刻（快速度）碾碎组织成粉末（注意：切莫使组织冻融）

6． 放进15毫升锥形离心管

7． 加入 毫升室温预热的固着液（Reagent B）

8． 平放置于摇床，室温下（25℃）孵育15分钟，速度为100RPM

9． 加入 微升室温预热的终止液（Reagent C）

10．继续平放置于摇床，室温下（25℃）孵育5分钟，速度为100RPM

11．放进台式离心机离心5分钟，速度为1000g

12．小心抽去上清液

13．加入 毫升预冷的清理液（Reagent A），混匀

14．放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为1000g

15．小心抽去上清液

16．重复实验步骤13至15二次

17．加入 毫升预冷的裂解液A（Reagent D），混匀

18．涡旋震荡5秒，充分混匀

19．置于冰槽里孵育10分钟

20．即刻放入预冷的DOUNCE匀浆器

21．在冰槽里用研磨棒匀化组织（约80下）（注意：参见注意事项6）

22．（选择步骤）准备1个小型漏斗，内衬尼龙丝，置于15毫升锥形离心管上

23．（选择步骤）将所有组织匀浆物移入到小型漏斗里过滤

24．将所有组织匀浆物移入15毫升锥形离心管

25．放进4℃台式离心机离心20分钟，速度为2000g

26．小心抽去上清液

27．加入 毫升裂解液B（Reagent E），混匀颗粒群

28．转移到1.5毫升离心管

29．放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如EPPENDORF 5415）

30．小心抽去上清液

31．加入 微升裂解液C（Reagent F），混匀颗粒群

32．准备1个新的1.5毫升离心管

33．加入 微升裂解液C（Reagent F）

34．小心加入 微升上述样品悬液在裂解液C（Reagent F）的上面

35．放进4℃微型台式离心机离心60分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如EPPENDORF 5415）

36．小心抽去上清液

37．加入 毫升核溶液（Reagent G），混匀颗粒群

38．置于冰槽里孵育10分钟

39．置于200瓦超声仪下，功率50％，猝击20秒，间隙10秒冷却，重复3次（注意：根据DNA的片段大小，增加超声次数）

40．放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如EPPENDORF 5415）

41．小心移取上清液分装到10个2毫升离心管（100微升/管）

42．其中： 1）选择1管进行1：50稀释后，测定OD260，确定DNA含量，使所有样品的检测浓度调整一致（注意：建议OD260＝0.1为佳）

2）或选择1管进行蛋白浓度检测，使所有样品的检测浓度调整一致（注意：蛋白总量1至5毫克为佳；

3）或选择1管进行去交联以及电泳鉴定超声处理的DNA片段（0.3至1.5kb）（注意：参见注意事项7）

43．选择1管继续后续操作，其余的保存在－70℃冰箱里

44．加入 微升稀释液（Reagent H）

二、 结合反应

1． 加入 微升结合液（Reagent I）

2． 平放置于4℃摇床孵育1小时，速度为100RPM

3． 放进4℃微型台式离心机离心1分钟，速度为400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

4． 小心移取上清液到2个新的2毫升离心管（每管500微升：1管为无抗体对照；1管为抗体处理管）

5． 加入50微升用户自备的特异抗体（总量为5微克）到抗体处理管

6． 将对照和抗体管平放置于4℃摇床孵育16小时，速度为100RPM

7． 加入 微升结合液（Reagent I）到抗体处理管

8． 将对照和抗体管平放置于4℃摇床孵育2小时，速度为100RPM

9． 将抗体管放进4℃微型台式离心机离心1分钟，速度为400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

10．小心抽去上清液

11．加入 毫升低盐液（Reagent J）到抗体管，混匀

12．平放置于4℃摇床孵育5分钟，速度为100RPM

13．放进4℃微型台式离心机离心1分钟，速度为400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

14．小心抽去上清液

15．加入 毫升高盐液（Reagent K）到抗体管，混匀

16．平放置于4℃摇床孵育5分钟，速度为100RPM

17．放进4℃微型台式离心机离心1分钟，速度为400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

18．小心抽去上清液

19．加入 毫升平衡液（Reagent L）到抗体管，混匀

20．平放置于4℃摇床孵育5分钟，速度为100RPM

21．放进4℃微型台式离心机离心1分钟，速度为400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

22．小心抽去上清液

23．加入 毫升缓冲液（Reagent M）到抗体管，混匀

24．平放置于4℃摇床孵育5分钟，速度为100RPM

25．放进4℃微型台式离心机离心1分钟，速度为400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

26．小心抽去上清液

27．重复实验步骤23至26一次

28．加入 微升洗脱液（Reagent N）到抗体管，混匀

29．平放置于摇床，室温下孵育15分钟，速度为100RPM

30．放进4℃微型台式离心机离心3分钟，速度为400g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

31．小心移取上清液到新的2毫升离心管

32．重复实验步骤28至31一次

33．小心移取上清液合并到上述2毫升离心管（注意：可以暂时停止，存放在－20℃，次日继续）

三、 DNA萃取

1． 分别加入 微升解联液（Reagent O）到抗体处理管和无抗体对照管，混匀

2． 置于65℃恒温水槽孵育2小时

3． 分别加入 微升酶解液（Reagent P）

4． 置于55℃恒温水槽孵育2小时

5． 室温下静置15分钟

6． 分别加入 微升萃取液（Reagent Q）（注意：使用前摇匀）

7． 涡旋震荡15秒

8． 放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

9． 分别移出450微升上层液相溶液到2个新的2毫升离心管（注意：切莫触碰液相交界面上的白色膜状物）

10．分别加入 微升浓缩液（Reagent R）到新的离心管

11．分别加入 毫升沉淀液（Reagent S）

12．涡旋震荡15秒

13．放进微型台式微型离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）（注意：离心前做好方位标记，以便离心后观察管底沉淀颗粒）

14．小心抽掉上清液

15．分别加入 毫升净化液（Reagent T）

16．放进微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

17．小心抽掉上清液

18．空气中晾干沉淀颗粒群

19．分别加入 微升缓冲液（Reagent M）

20．溶解后放进－20℃冰箱保存

四、 PCR扩增

1． 将扩增液（Reagent U）和补充液（Reagent V）从－20℃冰箱里取出

2． 置入冰槽里直至融化

3． 针对一个样本，每次移出 微升扩增液（Reagent U）到PCR管

4． 加入2微升上述结合实验中获得的DNA样品（总量100纳克）

5． 分别加入1微升用户自备的特异性的引物F和引物R（各350纳克或25微摩尔）

6． 再加入 微升补充液（Reagent V）（反应总量为25微升）

7． 即刻放进微型台式离心机瞬时离心5秒，速度为500g（或2000RPM；例如eppendorf 5415）

8． 加入50微升PCR级矿物油（注意：参见注意事项9）

9． 即刻进行热启动PCR反应：

10．反应完毕后，移取5微升进行1.5%琼脂糖凝胶电泳

11．如果进行测序鉴定，胶回收PCR产物（建议使用高质纯化一步法胶回收试剂盒；

12．分别移出2微升反应液到2个不同的新的1.5毫升离心管（每微升100纳克）

13．加入1微升用户自备的特异性巢式引物F（每微升350纳克）到其中一个1.5毫升离心管，作好标记

14．加入1微升用户自备的特异性巢式引物R（每微升350纳克）到另一个1.5毫升离心管，作好标记

15．进行后续的直接测序反应

注意事项

1． 本产品为10次（1克植物组织样本）操作

2． 操作时，须戴手套

3． 固着处理必须在室温下进行，其余的操作均须在4℃状态进行

4． 严格按照操作规程进行

5． 建议使用无抗体对照

6． 通常匀化次数为80下达到80％的组织细胞裂解为理想状态，但不同的组织类型会存在差异。用户可以通过显微镜观察3微升匀浆物的组织细胞裂解程度：完整细胞呈现发亮的圆环。低于50％可以增加匀化次数

7． 通常超声处理后的DNA片段大小为0.3至1.5kb；如果使片段小于1.0kb，增加超声次数或功率即可。电泳鉴定前，加入10微升解联液（Reagent O）到1管100微升超声处理后样品，65℃孵育4小时，移取20微升进行1.0％琼脂糖凝胶电泳。其标准片段电泳图象如下：泳道1为DNA标准样；泳道2为未经超声处理样品；泳道3为超声处理后样品；泳道4为强化超声处理后样品 

8． 根据用户PCR仪的性能，决定是否加入矿物油（Mineral Oil）

9． 建议使用软件测算Tm温度；参考公式为Tm=4（G+C）+2（A+T）

10．在－20℃冰箱里储存的产品避免反复冻融

11．本公司提供系列CHIP分析试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定不含污染性蛋白酶和核酶