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产品简介：

确定基因的转录起始位点和终止位点是研究基因结构和功能的最重要工作之一，最-通用的方法是 Frohman 发明的 Rapid Amplification of cDNA Ends。其用于确定转录起始位点的方法叫 5′ RACE 法，用于确定转录终点的方法叫 3′ RACE 法。它们是通过PCR 快速克隆 cDNA 末端，在不建立 cDNA 文库的前提下，利用已知 cDNA 序列设计引物，通过向 mRNA 两端延伸和扩增获得两个末端的序列。本试剂盒就是根据 RACE 技术开发的确定mRNA 5′末端的试剂盒。

产品特点：

1.即开即用，客户只需要准备总 RNA（或 mRNA）和专一性引物，不用准备其他试剂。

2.反应条件经过精心优化，不需要用户辛苦摸索条件。

3.本产品足够 10 次 5′ RACE 实验。

4.改良 5′ RACE 试剂盒只能用于科研。

产品参数：

成分 规格包装

MMLV 逆转录酶-RI 混合液 20 μL0.5 mL 蓝盖管

MMLV Buffer-dNTP 混合液 50 μL0.5 mL 黄盖管

微量核酸沉淀剂 400 μL0.5 mL 绿盖管

2×TdT Buffer（含 dATP） 200 μL0.5 mL 橙盖管

TdT（末端转移酶） 10 μL0.5 mL 红盖管

2×PCR MasterMix 1 mL×21.5 mL 本

5′ RACE 引物 A-

引物 B 混合干粉 10 次0.5 mL 紫

5′ RACE 引物 C 干粉 10 次0.5 mL 白

RNase-Free 水1 mL1.5 mL 亮

使用手册 1 份无

运输及保存

低温运输、-20℃保存、有效期一年。

自备试剂

mRNA（或总 RNA）、基因专一性引物 A、B、C、75%乙醇。注意：自备的基因专一性引物A，B，C 的相对位置必须跟本手册产品介绍中的示意图一致。

使用方法：

1.变性模板 RNA：将 1 μg mRNA 或 5 μg 总 RNA 加入到一个 RNase-Free 的塑料管中，补 RNase-Free 水到 11 μL，65℃保温 5 分钟打开 RNA 的二级结构后短暂离心，立即放冰上待用。如果 RNA 浓度偏低，加 RNase-Free 水之前体积就已超过10 μL,则需要使用核酸浓缩剂（需另购）浓缩到所需的体积。

2.在塑料管中按顺序加入：2 μL 自备的基因专一性引物A（浓度为 10 μM），5 μL MMLV Buffer-dNTP 混合液，2 μL MMLV 逆转录酶-RI 混合液，总体积为 20 μL，轻柔吹打混匀。

3. 37℃保温 60 分钟，42℃保温 30 分钟，50℃保温 10 分钟，最后 75℃保温 10 分

钟使逆转录酶变性，短暂离心 5 秒后待用。

4.在塑料管中加入 40 μL 微量核酸沉淀剂（含不溶的核酸助沉剂，用前需要充分摇匀再取用），震荡混匀。

5.室温 12000×g 离心 15 分钟，沉淀即为 cDNA。小心吸弃上清。此步沉淀可以去除多余的 dNTP，它们会严重干扰后续的 TdT 加尾反应。

6.加入 1 mL 自备 75%乙醇，室温 12000×g 离心 5 分钟，小心吸弃上清。此步洗涤可以洗去逆转录反应中残留的dNTP，它们会严重干扰后续的 TdT 加尾反应。

7.短暂离心数秒，小心吸弃残留液体（约 50 μL），晾干 2 分钟。

8.加入 20 μL RNase-Free 水，充分吹打溶解 cDNA 沉淀。注意：为保证加尾效率，溶解 cDNA 的 RNase-Free 水最好不要超过 20 μL，否则 cDNA 模板浓度太稀。

9.在两个塑料离心管中按下表设置加尾反应：

成分加尾样品管加尾阴性对照管

cDNA溶液（上步所得）9 μL9 μL

2×TdT Buffer（含dATP）10 μL10 μL

RNase-Free水不加1 μL

TdT酶1 μL不加

10.37℃保温 15 分钟进行加尾反应，然后 75℃保温 3 分钟灭活末端转移酶。

11.在两个反应管中各加入 0.5 mL RNase-Free 水稀释样品，此 250 倍稀释液将作为下步PCR 的模板。

12.第一轮 PCR：按下表分别使用不同体积的样品稀释液设置四个 50 μL 的PCR 反应，客户还需要按下表设置四个以阴性对照稀释液做模板的PCR 反应，只是将表中的样

品管稀释液改成阴性对照稀释液。共 8 个PCR 样品。

成分梯度1梯度2梯度3梯度4

PCR MasterMix25 μL25 μL25 μL25 μL

自备基因专一性引物 B（10 μM）  2.5 μL   2.5 μL   2.5 μL    2.5 μL 5′ RACE 引物 A-引物B 混合液     2.5 μL   2.5 μL   2.5 μL    2.5 μL样品管稀释液1 μL     5 μL     10 μL    15 μL

RNase-Free 水19 μL    15 μL    10 μL     5 μL

13.按下列条件进行 PCR（注：应根据自备引物的 Tm 值选择适当的退火温度，下面的参数仅仅供参考）。

第 1 次循环：94℃ 5 min，48-52℃ 2 min，72℃ 4 min

第 2-30 次循环：94℃ 40 sec，52-60℃ 1 min，72℃ 3 min

最后延伸：72℃ 15 min

14.直接取 20 μL PCR 产物进行琼脂糖电泳检查 PCR 结果(样品组 4 个样，阴性对照组 4 个样)。如果样品有一条清晰的扩增条带，并且阴性对照在相应的位置没有扩增产物，则可以不做后续的第二轮PCR，直接进行 DNA 测序或切胶克隆。如样品没有任何一条清晰的扩增条带，则进入第二轮 PCR。

15.第二轮 PCR：从 8 管PCR 产物中各取 1 μL 分别加入到 20 μL RNase-Free 水中进行稀释 20 倍，再各取 1 μL 分别作为第二轮PCR 的模板，再加入 25 μL PCR MasterMix，2.5 μL 5′ RACE 引物 C，2.5 μL 自备基因专一性引物 C（10 μM），补水到共 50 μL 。

16. 按下列条件进行 PCR：第 1-30 次循环（94℃ 40 sec，52-60℃ 1 min，72℃ 3

min），最后延伸：72℃ 15 min

17. 直接取 20 μL PCR 产物进行琼脂糖电泳，一般会有至少一个样品有清晰的条带出现，则可以直接进行DNA 测序或 TA 克隆。

选择我们的改良 5′ RACE 试剂盒，就是选择精准、高效、可靠的检测方案，为您的科研实验保驾护航！